桃褐腐菌角質(zhì)酶的克隆與表達(dá).pdf

1、角質(zhì)酶是一種具有水解酯鍵能力的酶，屬于α/β水解酶家族中的一種?？梢源呋飧鞣N長(zhǎng)短鏈的甘油三酯等酯類(lèi)。由于反應(yīng)條件溫和、催化效率高等特點(diǎn)，近些年來(lái)在紡織、食品等行業(yè)中應(yīng)用非常廣泛。桃褐腐菌(Monilinia fructicola)是一種可致桃樹(shù)果實(shí)腐爛的真菌，對(duì)果實(shí)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。其侵染桃果實(shí)的主要過(guò)程就是誘導(dǎo)自身表達(dá)角質(zhì)酶，分解桃果實(shí)表皮中的角質(zhì)類(lèi)物質(zhì)?，F(xiàn)階段對(duì)于基因工程生產(chǎn)角質(zhì)酶的研究集中在腐皮鐮胞菌(Fusarium s

2、olani)角質(zhì)酶基因和嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)等菌種中，通過(guò)獲取這兩類(lèi)菌體中的角質(zhì)酶基因進(jìn)行基因工程菌的構(gòu)建。然而文獻(xiàn)中對(duì)于桃褐腐菌角質(zhì)酶基因的應(yīng)用并不深入。原核基因工程表達(dá)系統(tǒng)具有發(fā)酵時(shí)間短、高效、構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌(E.coli)BL21及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)兩種表達(dá)系統(tǒng)，分別使用pET-28a質(zhì)粒及pET-PK質(zhì)粒。在大腸桿菌的甘油代謝途徑中，

3、pET-28a可由IPTG誘導(dǎo)T7啟動(dòng)子大量胞內(nèi)表達(dá)重組載體中的基因片段。在肺炎克雷伯菌的甘油代謝途徑中，由于克雷伯菌自身的組成型啟動(dòng)子是PK啟動(dòng)子，在甘油存在的條件下即可表達(dá)。pET-PK質(zhì)粒由pET-28a質(zhì)粒改造而得，將原有的T7啟動(dòng)子換成PK啟動(dòng)子后，下游連接重組片段參與工程菌的組成型胞內(nèi)表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)獲取桃褐腐菌角質(zhì)酶基因cut1，分別連接至pET-28a與pET-PK質(zhì)粒中。重組大腸桿菌pET-28 A-c

4、ut1/BL21由化學(xué)法轉(zhuǎn)化而得，重組克雷伯菌pET-PK-cut1/k.p由電轉(zhuǎn)化方法而得。通過(guò)對(duì)兩株重組菌表達(dá)條件分析、表達(dá)生物量測(cè)定、表達(dá)單位蛋白量測(cè)定、表達(dá)單位酶活量測(cè)定等步驟，可確定重組大腸桿菌在誘導(dǎo)表達(dá)18小時(shí)后產(chǎn)生角質(zhì)酶的酶活可達(dá)每100μL4 U，重組克雷伯菌在表達(dá)21小時(shí)后酶活可達(dá)每100μL5U，然而重組克雷伯菌的單位蛋白量并沒(méi)有顯著提高，說(shuō)明表達(dá)量尚有可上升的空間。此外，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組畢赤酵母pPICZαA-