miRNA-145-5p在真武湯干預腎小球腎炎免疫損傷中的作用及機制.pdf

1、慢性腎小球腎炎(Chronic glomerulonephritis，CGN)是由多種原因引起的免疫炎癥性疾病，其發(fā)病隱匿，病因復雜，發(fā)病機制至今尚未完全明確。近年來，miRNAs作為是一類內(nèi)源性、小分子非編碼RNA，廣泛參與各類腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展，有望進一步解釋CGN發(fā)病的分子機制。白介素10（Interleukin-10，IL-10）是一種多細胞來源、功能多樣的炎癥與免疫抑制細胞因子，參與機體免疫炎性反應。在腎臟中，IL-10由腎小

2、球系膜細胞和內(nèi)皮細胞生成和分泌，參與調(diào)控正常腎生理功能，也在腎臟疾病中的細胞、分子間信號通路起著重要的轉導作用。越來越多研究證實，IL-10與miRNA之間存在直接或間接的相互影響作用，共同參與機體腎臟疾病過程中免疫應答調(diào)控。中醫(yī)藥在慢性腎炎領域的預防和治療具有明顯的潛力和優(yōu)勢，真武湯作為溫陽利水名方，臨床和實驗都證實其對慢性腎炎療效確切，但慢性腎炎本身發(fā)病機制復雜，隨著研究的深入，一些新的發(fā)病機制被不斷得到闡明;另外，由于中藥復方的作

3、用多靶點性，機制復雜，尚需不斷擴展真武湯對慢性腎炎的藥理機制，為臨床應用提供更多的實驗依據(jù)。
　　目的:
　　1.制備陽離子化小牛血清蛋白(C-BSA)所致CGN大鼠動物模型，應用真武湯給藥治療干預，從尿蛋白量、腎功能、腎病理形態(tài)學改變、血清炎性因子含量和腎組織炎性因子的表達水平等指標評價真武湯對CGN大鼠腎功能、病理和免疫炎癥的改善作用。
　　2.利用miRNA微陣列芯片篩選正常和CGN大鼠差異表達的miRNAs，并

4、用實時熒光定量PCR驗證芯片結果可靠性。在miRNA差異表達譜中找出在大鼠腎系膜細胞上有高表達的miRNA，預測其調(diào)控的靶基因，進行下一步功能研究。
　　3.培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞(MC)，利用脂多糖(LPS)刺激誘導MC建立炎性增殖模型。利用真武湯含藥血清干預，考察真武湯含藥血清對MC的增殖、生長周期和凋亡的影響，揭示真武湯對MC的增殖、凋亡的影響。
　　4.對MC轉染miR-145-5p的mimic和inhibitor，

5、檢測miR-145-5p和IL-10 mRNA的表達變化，揭示兩者之間的關系。同時研究IL-10介導的PI3K/AKT信號通路的變化情況，在IL-10/AKT通路水平上進行miR-145-5p功能研究。
　　方法:
　　1.取SD大鼠，腹腔注射C-BSA對大鼠預免疫兩周后，連續(xù)4周尾靜脈注射C-BSA誘導CGN大鼠動物模型。自造模開始第4周起，給予真武湯低、高劑量(4.2g/kg、8.4g/kg)，連續(xù)灌胃4周。以大鼠尿蛋白

6、、血肌酐、尿素氮和腎臟病理形態(tài)學等指標評價真武湯對CGN大鼠腎功能的保護作用。以巨噬細胞侵染腎小球、血清中IL-10、 IL-1α和IL-2含量、腎組織中IL-10、TNF-α、IL-2和IL-6 mRNA的表達水平等指標考察真武湯對CGN大鼠免疫炎癥的改善作用。
　　2.取正常組和CGN模型組大鼠腎組織各3例，經(jīng)miRNA標記后，進行miRNA芯片雜交。應用GenePix Pro6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值，根據(jù)信

7、號值篩選兩組樣品間的差異表達miRNA。選取模型組上調(diào)表達的miR-145-5p和下調(diào)表達的miR-153-3p進行實時熒光定量PCR驗證。
　　3.應用脂多糖(LPS，10μ g/mL)刺激誘導MC炎性增殖模型，并用真武湯含藥血清進行干預。應用MTT和CCK8法測定真武湯對MC增殖的影響;PI染色后流式細胞術測定真武湯對ME周期的影響;AnexinⅤ/FITC測定各組MC凋亡情況。
　　4.對ME進行miR-145-5p

8、mimic(50nM)、inhibitor(100nM)轉染，轉染24h后，應用LPS(10μ g/mL)刺激MC炎癥反應，并用真武湯含藥血清進行干預。實時熒光定量PER檢測miR-145-5p、IL-10 mRNA的表達水平;蛋白印跡法(Western Blot)檢測AKT、GSK-3α、GSK-3β、p65蛋白的磷酸化和p65、Cyclin D1總蛋白水平，評價miR-145-5p和真武湯對ME增殖的影響以及PI3K/AKT/GSK

9、信號通路和NF-KappaB的影響。
　　結果:
　　1.與模型組相比，真武湯可增加大鼠尿液排出、降低24h尿蛋白;降低血肌酐和尿素含量，保護腎功能;真武湯可以減輕腎小球炎性細胞浸潤和腎小球肥大、腎小管上皮細胞的顆粒樣變性，抑制系膜基質(zhì)增殖，改善腎病理病變。真武湯可通過增加抗炎因子IL-10合成分泌，減少促炎因子IL-1α、IL-2、IL-6、TNF-α，抑制CGN大鼠的免疫炎癥反應，繼而減輕腎臟免疫損傷。
　　2.比

10、較分析正常和CGN大鼠腎組織的miRNA差異表達譜，共篩選出差異表達miRA(fold change＞2.0)共有26個，其中模型組顯著上調(diào)miRNA有3個，23種miRNA表達下調(diào)，提示miRNA在CGN的發(fā)病與發(fā)展發(fā)揮著重要作用。實時熒光定量PCR結果顯示，與正常組比較，模型組腎組織miR-145-5p表達上調(diào)2.96倍，miR-153-3p下調(diào)2.65倍，與芯片結果趨勢一致，證明芯片結果可靠性高。
　　3.與LPS模型組比較

11、，真武湯可以明顯抑制MC的增殖，將MC有絲分裂抑制于G0期，但對MC的凋亡沒有明顯影響。
　　4.與模型組比較，miR-145-5p和真武湯都可以抑制LPS所致的MC增殖異常、促進IL-10mRNA的表達;還可以抑制AKT、GSK-3α、GSK-3β、p65蛋白的磷酸化，降低Cyclin D1總蛋白表達水平。
　　結論:
　　1.真武湯可以通過增加CGN大鼠尿量、降低24h尿蛋白保護腎功能，減輕大鼠腎臟病理改變，抑制腎

12、小球免疫炎癥反應，減輕免疫應答損傷。
　　2.在CGN大鼠中有26個差異表達的miRNA參與CGN的發(fā)病與發(fā)展，其中miR-145-5p與真武湯在LPS刺激系膜細胞產(chǎn)生炎癥應答中起重要調(diào)控作用相似，均可以上調(diào)IL-10的表達，通過抑制PI3K/AKT/GSK信號通路參與炎癥因子分泌的負反饋調(diào)節(jié)。
　　3.miR-145-5p和真武湯還可以通過降低Cyclin D1的表達，抑制MC的異常增殖;抑制NF-KappaB的活化，調(diào)控