原花青素通過NrF-2信號通路對大鼠肌腱抗氧化應激作用的研究.pdf

1、目的：原花青素可以通過上調Nrf-2通路明顯的抑制氧化應激對多種組織器官造成的損傷，但該作用在肌腱組織中鮮見報道。本文旨在研究原花青素對肌腱抗氧化應激的作用，初步明確原花青素的抗氧化作用機制，為肌腱損傷的發(fā)病機制及治療提供實驗數據和理論基礎。
　　方法：一、細胞實驗1、從SD大鼠肌腱組織中提取肌腱干細胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)，并進行傳代培養(yǎng)至第3代，用于后續(xù)實驗。2、通過流式細胞術對提取

2、的TDSCs進行細胞種類鑒定。3、以不同濃度的原花青素(Proanthocyanidins，PCs)單獨作用于TDSCs，排除PCs對TDSCs的毒副作用。4、以不同濃度的H2O2作用于TDSCs，摸索構建氧化應激模型的最佳濃度——半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。5、將半抑制濃度的H2O2作用于經不同濃度的PCs預處理的TDSCs，并通過CCK-8法來測定TDSCs的細

3、胞活性。6、應用Real Time-PCR法及Western Blot法檢測PCs對TDSCs中Nrf-2基因及其下游GCLM、HO-1、NQO-1基因表達的影響。二、動物實驗1、取15只成年雄性SD大鼠，分為空白組、對照組（過度使用模型組）、實驗組(PCs預處理+過度使用組)三組，每組5只。2、對空白組、對照組中的大鼠僅以滅菌水灌胃，而實驗組則以100mg/kg PCs灌胃。3、將SD大鼠放置于大鼠跑臺上，以17m/min的速度進行1

4、0°的上坡跑，每天進行1h，每周進行5天，以建立肌腱過度使用的模型。在進行正式模型建立之前，進行5天適應訓練。4、建立模型2周后取大鼠眼球血血清，進行氧化應激指標SOD、MDA、抗·OH及抗O2·-的測定。5、取SD大鼠肌腱組織，行病理切片HE染色。
　　結果：1、分離的TDSCs在P3呈紡錘狀、多角狀等形態(tài)生長，并結合流式細胞術對其表面標記物測定結果顯示，有96.8％的細胞對間充質干細胞標記CD90（陽性標記物）高表達，僅有0.

5、65％對內皮細胞標記CD31表達（陰性標記物），并根據相關文獻結果證實分離細胞為TDSCs。2、在CCK-8試驗中，不同濃度的PCs單獨作用于TDSCs，細胞活性無明顯差異，證實PCs對TDSCs無明顯毒副作用。且在H2O2的處理下，經PCs預處理的TDSCs細胞活性明顯高于H2O2組，且各濃度PCs組之間的細胞活性無明顯差異，證實PCs在低濃度狀態(tài)下即可發(fā)揮出強大的抗氧化作用。3、在RT-PCR檢測中，與對照組相比，H2O2和PCs的

6、單獨作用都可上調TDSCs中Nrf-2及其下游基因GCLM、NQO-1、HO-1的表達，且PCs的作用更明顯，而PCs+ H2O2組的各個基因表達均達到最高水平。4、在WB檢測中，雖然在各種組中Nrf-2的蛋白表達無明顯統(tǒng)計學差異，但在各組間的表達中呈上升的趨勢。而GCLM及HO-1的表達在H2O2、PCs、PCs+ H2O2三組中的表達依次增高，與RT-PCR結果一致。5、在動物實驗中，過度使用組MDA水平明顯增高，表明大鼠肌腱過度使

7、用模型造模成功，且SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力在過度使用組中均有相應增強。而PCs組中MDA水平較過度使用組明顯降低，顯示出PCs的抗氧化作用，同時SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力也得到了較大的增強。6、在大鼠肌腱的病理切片中，低倍鏡(100×)下可見在正常肌腱組織內，肌腱纖維蛋白組織互相平行，且相互排列緊密有序。在高倍鏡(400×)下可見細胞核深染且呈紡錘型或梭型，位于肌腱纖維蛋白組織中央。而在過度使用組中，可見到肌腱纖維

8、蛋白組織明顯的紊亂甚至斷裂，而細胞核變圓且著色加深。經PCs處理的大鼠肌腱組織，在病理切片中可見比較明顯的結構紊亂，排列稀疏，但未見明顯的肌腱纖維斷裂。雖然實驗組的細胞核也有向圓形發(fā)展的趨勢，但仍可見少量梭型或紡錘形的細胞核?？梢娊汸Cs處理后肌腱組織在形態(tài)學上較過度使用組有明顯的改觀。
　　結論：1、PCs單獨作用于TDSCs時無明顯的細胞毒性作用，且能通過上調TDSCs中Nrf-2的表達，從而進一步上調其下游基因GCLM、NQ