Akt信號通路通過激活TFEB而抑制氧化應激誘導的神經(jīng)細胞凋亡.pdf

1、機體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡所引起的氧化應激（oxidative stress，OS），可造成細胞內(nèi)蛋白質、RNA、DNA的損傷。氧化應激過程中產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）介導脂質過氧化、降低NO生物活性、以及激活炎癥基因等一系列病理生理學反應。越來越多的研究表明，氧化應激可以誘發(fā)多種疾病，例如神經(jīng)退行性疾?。╪eurodegenerative disease）、動脈硬化、以及糖尿病等。在中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)中，過量的ROS可以導致小膠質細胞活化、神經(jīng)元以及星形膠質細胞的損傷。帕金森?。≒arkinson’s disease,PD）是一種中樞系統(tǒng)慢性退行性疾病，其病理特征為多巴胺神經(jīng)元選擇性和漸進性退化以及由氧化應激誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。
　　Akt，又稱蛋白激酶B（PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該激酶可以調控細胞增殖、細胞遷徙以及細胞凋亡。最近有研究表明，Akt信號通路介導神經(jīng)元的存活，對PD患者的神經(jīng)元有保護作用。

3、例如，Akt/Rheb的激活可以使中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突再生，并且在PD病人的腦組織中，Akt的表達和磷酸化水平明顯降低。對Akt作用機理的研究證實，Akt可以通過磷酸化多種凋亡相關蛋白來抑制細胞凋亡。但Akt信號通路對氧化應激誘導的神經(jīng)細胞凋亡有何影響目前尚不清楚。
　　TFEB（transcription factor EB），是亮氨酸拉鏈bHLH-Zip轉錄因子家族中MiT/TFE家族中的成員。有文章報道，TFEB參與溶酶體合成

4、和功能的調節(jié)，調控細胞自噬，并與神經(jīng)退行性疾病、癌癥、以及溶酶體貯積癥等多種疾病相關。最近有報道稱，過表達TFEB可以防止MPTP誘導的多巴胺神經(jīng)元凋亡；TFEB的激活能減輕α-synuclein在腦組織中的異常聚集以及氧化應激和炎癥造成的神經(jīng)細胞的損傷。盡管既往研究已經(jīng)證實， Akt信號通路和TFEB均參與了細胞存活和細胞凋亡的調節(jié)，但是在氧化應激條件下，Akt信號通路和TFEB之間在功能上的聯(lián)系尚待闡明。本研究旨在探討Akt信號通路

5、和TFEB之間如何協(xié)同拮抗氧化應激誘導的神經(jīng)元細胞凋亡。
　　第一部分：TFEB介導Akt信號通路對過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用
　　目的：
　　探討Akt信號通路對過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響，明確Akt信號通路和TFEB在拮抗過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞凋亡中的相互關系。
　　方法：
　　1.MTT實驗檢測不同濃度的過氧化氫對SH-SHY5Y細胞活力的影響及其與Akt信號通路的關系。
　　2

6、.Western blot檢測不同濃度的過氧化氫對 Akt磷酸化及其與PARP活化之間的關系。
　　3.流式細胞術檢測阻斷Akt信號通路后過氧化氫對細胞凋亡的影響，以及過表達TFEB阻斷或激活Akt信號通路對過氧化氫誘導的細胞凋亡的影響。
　　4.免疫共沉淀實驗檢測TFEB與Akt的結合。
　　結果：
　　1.Akt信號通路在過氧化氫誘導的SH-SHY5Y細胞凋亡中受到抑制因Akt信號通路介導生長因子誘導的神經(jīng)細

7、胞的生存，且過多的ROS損傷神經(jīng)細胞，所以我們首先檢測 Akt信號通路是否在過氧化氫誘導的SH-SHY5Y細胞凋亡中受到的影響。用不同濃度的過氧化氫處理SH-SHY5Y細胞，MTT實驗結果顯示，過氧化氫濃度在100μM和200μM時，SH-SHY5Y細胞活力輕微增加；而過氧化氫濃度在400μM和800μM時，SH-SHY5Y細胞活力顯著降低。Western blot結果顯示，當SH-SHY5Y細胞給予400μM和800μM的過氧化氫時，

8、Akt磷酸化水平顯著降低，說明在過氧化氫誘導SH-SHY5Y細胞凋亡過程中Akt信號通路受到抑制。
　　流式細胞術分析結果顯示，當用Akt和PI3K抑制劑 wortmannin預處理后，再給予400μM的過氧化氫刺激時，氧化應激誘導的細胞凋亡明顯加重。Western blot結果也顯示，Akt和 PI3K抑制劑可以完全阻斷Akt的磷酸化，并且細胞凋亡標志物的剪切即cleaved-PARP顯著增加。另外，用持續(xù)激活的HA-Akt-C

9、A或它的失活突變體HA-Akt-KD轉染SH-SHY5Y細胞后，給予過氧化氫刺激。MTT結果顯示，HA-Akt-CA轉染的SH-SHY5Y細胞受到過氧化氫刺激后，其凋亡率顯著降低。綜上所述，這些結果表明，Akt信號通路在氧化應激誘導的神經(jīng)細胞凋亡中受到抑制。
　　2.TFEB抑制過氧化氫誘導的SH-SHY5Y細胞凋亡與Akt信號通路相關
　　因為TFEB抑制細胞凋亡，所以我們進一步檢測過氧化氫誘導的SH-SHY5Y細胞凋亡是

10、否受TFEB的影響。用重組腺病毒Flag-TFEB感染SH-SHY5Y細胞后，用Western blot和流式細胞術檢測細胞凋亡。在TFEB過表達的細胞中，過氧化氫引起的PARP的活化受到抑制，并且Akt抑制劑能減少TFEB過表達抑制的PARP的活化。同樣，在TFEB過表達的細胞中，再給予Akt信號通路的激活劑EGF時，過氧化氫引起的PARP的活化被取消。我們發(fā)現(xiàn)，不管是否給予過氧化氫刺激，在SH-SHY5Y細胞中過表達TFEB均會顯著

11、抑制細胞凋亡。
　　為了進一步檢測TFEB抑制細胞凋亡是否與Akt信號通路相關，用Akt inhibitor或Akt激活劑EGF預處理細胞后，再給予過氧化氫刺激。流式細胞分析結果顯示，過表達TFEB可以顯著減少由Akt inhibitor和過氧化氫共同引起的細胞凋亡。相反，Akt信號通路的激活劑EGF減少氧化應激引起的細胞凋亡，過表達TFEB的細胞再給予EGF處理可進一步減少過氧化氫誘導的細胞凋亡。這些結果表明，TFEB抑制氧化應

12、激誘導的細胞凋亡受Akt信號的調節(jié)。
　　3.TFEB與Akt存在相互作用
　　上述研究證實，TFEB抑制SH-SHY5Y細胞凋亡受Akt信號通路的調節(jié)，我們進一步研究Akt是否可以直接與TFEB相互作用。用野生型的HA-Akt-WT和GST-TFEB轉染細胞，GST pull down實驗結果顯示，HA-Akt可以直接與GST-TFEB結合，但不與GST相互作用。用免疫共沉淀實驗檢測內(nèi)源性的Akt是否與TFEB結合，結果顯

13、示，在TFEB抗體的免疫沉淀物中檢測到Akt蛋白的存在。為了進一步驗證TFEB的哪個結構域與Akt結合，用可表達全長TFEB及其不同結構域的表達載體GST-TFEB-FL/GST-TFEB-1-294/GST-TFEB-295-476和HA-Akt-WT共轉染HEK293T細胞，通過GST pull down實驗檢測全長TFEB（TFEB-FL）和各種截短突變體與Akt的結合情況。結果顯示，全長TFEB（TFEB-FL）和包含HLH結構

14、域的N端結構域（TFEB-1-294）可以與Akt的結合。當TFEB的N端結構域（TFEB-1-294）被消除時，突變體喪失與Akt的結合。
　　為了進一步檢測TFEB與Akt的結合是否受Akt活性的影響，將持續(xù)激活型Akt(HA-Akt-CA)/失活型Akt(HA-Akt-KD)/部分失活型Akt(HA-Akt-*KD)和GST-TFEB共轉染HEK293T細胞，GST pull down結果顯示，TFEB與不同活性形式的Akt

15、均可結合。持續(xù)激活型Akt與TFEB結合能力最強，失活型Akt與TFEB的結合最少。為了進一步檢測Akt不同結構域與TFEB結合的實驗結果顯示，TFEB不能與Akt-PH或者Akt-Cat結合，但與Akt-tail具有較強的結合能力。
　　小結:
　　1.Akt信號通路在過氧化氫誘導的SH-SHY5Y細胞凋亡中受到抑制。
　　2.TFEB通過與Akt相互作用介導過氧化氫對SH-SHY5Y細胞凋亡的影響。
　　第二

16、部分：Akt磷酸化TFEB的Ser467位點
　　目的：
　　探討Akt是否可以磷酸化TFEB以及Akt對TFEB進行磷酸化修飾的位點。
　　方法：
　　1.用Akt、PI3K和ERK抑制劑處理細胞，Western blot檢測TFEB的磷酸化；在SH-SHY5Y細胞中表達TFEB和TFEB-S467A并給予insulin或Akt inhibitor處理，Western blot檢測TFEB-S467位點的磷酸化

17、。
　　2.用TFEB截短突變體和不同磷酸化位點突變體轉染細胞，Western blot檢測Akt抑制劑和激活劑insulin對TFEB-S467磷酸化的影響。
　　3.體外Akt活性實驗檢測TFEB與Akt共孵育后TFEB-S467的磷酸化。
　　結果：
　　1.Akt磷酸化TFEB
　　分別用 PI3K抑制劑 Wortmannin、Akt inhibitor和 ERK抑制劑PD98059預處理過表達 T

18、FEB的細胞，然后給予insulin刺激，用p-Akt-substrate抗體檢測TFEB的磷酸化。Western blot結果顯示，給予insulin刺激后，Akt-Ser473的磷酸化水平和Akt底物的磷酸化水平顯著升高，PI3K和Akt抑制劑能取消insulin對TFEB和Akt底物磷酸化的誘導， ERK的抑制劑不影響它們的磷酸化。GST pull down實驗結果顯示，持續(xù)活化型的Akt與Akt底物的結合多于野生型Akt和失活型

19、的Akt。用GST-TFEB轉染HEK293T細胞后，再分別給予insulin或者Akt inhibitor刺激。結果顯示，insulin處理后Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平升高；而Akt inhibitor抑制Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平。另外，來源于HEK293T細胞中內(nèi)源性TFEB經(jīng)Akt激活劑或者抑制劑處理后得到相同的結果。這些結果表明TFEB可以被Akt磷酸化。
　　2.Akt磷酸化TFEB

20、的Ser467位點
　　構建可表達TFEB不同截短突變體的表達載體轉染細胞后，用p-Akt-substrate抗體檢測不同截短突變體的磷酸化。結果顯示全長TFEB(TFEB-FL)和它的C-端部分(TFEB-320~476,氨基酸320~476)可以被Akt磷酸化，而N-端部分(TFEB-1~319,氨基酸1~319)卻不能被Akt磷酸化。說明TFEB-320~476包含Akt磷酸化位點。當TFEB-320~476被進一步截短時，

21、我們發(fā)現(xiàn)，TFEB-352~476(氨基酸352~476)可以被Akt磷酸化，提示TFEB被Akt磷酸化的絲氨酸存在于461到476氨基酸之間。進一步把461到476氨基酸之中的絲氨酸都進行點突變。Western blot結果顯示，TFEB-S462A和TFEB-S466A以及野生型的TFEB均可以被Akt磷酸化；相反， TFEB-S463/467A和TFEB-S467/469A突變體不能被Akt磷酸化。這些結果表明Ser467是Akt

22、磷酸化TFEB的位點。
　　3.Ser467是Akt磷酸化TFEB的特異性位點
　　為了進一步證實Ser467是Akt磷酸化TFEB的位點，我們制備了特異性的抗 TFEB-S467磷酸化抗體，用其檢測Akt激活劑或者抑制劑對TFEB-S467磷酸化的影響。免疫沉淀結果顯示，給予insulin刺激時，S467A突變體不能被Akt磷酸化，并且不受Akt-Ser473被insulin磷酸化的影響。同樣，用Akt inhibitor

23、處理穩(wěn)定表達Flag-TFEB或TFEB-S467A的細胞株時，TFEB-Ser467和Akt-Ser473的磷酸化都會受到抑制。另外，分別用過Wortmannin、Akt inhibitor和ERK抑制劑 PD98059預處理細胞后給予insulin刺激，結果顯示，Insulin可以顯著增強 TFEB-Ser467磷酸化，但在PI3K/Akt抑制劑處理的細胞中不能上調TFEB-Ser467磷酸化水平。體外激酶活性分析也證明突變體TFE

24、B-S467A不能被Akt磷酸化。綜上所述，TFEB被Akt磷酸化的位點是Ser467。
　　小結:
　　1.Akt磷酸化TFEB。
　　2.Akt磷酸化TFEB的Ser467位點。
　　第三部分：Akt通過磷酸化TFEB而抑制過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞凋亡
　　目的：探討Akt信號通路抑制過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞凋亡的作用機制。
　　方法：
　　1.Western blot檢測 SH-SHY5Y或神

25、經(jīng)元細胞被重組慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后，過氧化氫、Akt抑制劑、EGF對PARP活化的影響。
　　2.流式細胞術檢測SH-SHY5Y或神經(jīng)元細胞被重組慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后，過氧化氫、Akt抑制劑、EGF對細胞凋亡的影響。
　　3.小鼠中腦注射重組腺病毒GFP、TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D后，免疫組化染色觀察MPT

26、P對小鼠中腦神經(jīng)元凋亡的影響。
　　結果：
　　1.Akt誘導的TFEB磷酸化抑制過氧化氫引起的SH-SHY5Y細胞凋亡首先，我們用野生型的TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D（相當于持續(xù)活化的TFEB）感染SH-SHY5Y細胞，檢查過氧化氫對PARP活化的影響。Western blot結果顯示，過表達TFEB和TFEB-S467D可以顯著減少過氧化氫誘導的PARP活化，而TFEB-S467A對PARP活化

27、沒有影響。為了進一步證實 TFEB抑制細胞凋亡依賴于Akt信號通路，用 Akt抑制劑或激活劑預處理過表達 TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D的SH-SHY5Y細胞后，再給予過氧化氫刺激。Western blot結果顯示，過表達TFEB-S467D的細胞與TFEB-S467A細胞相比，過氧化氫或Akt抑制劑引起的PARP活化顯著減少；用 EGF激活Akt信號通路后，過表達TFEB-S467A的細胞與過表達野生型TFEB和

28、TFEB-S467D的細胞相比，過氧化氫誘導的PARP活化并沒有明顯減少。
　　另外，流式細胞術結果顯示，過表達TFEB和TFEB-S467D可以顯著抑制由過氧化氫誘導的細胞凋亡，而S467A突變體失去了這種抑制作用。無論單獨給予過氧化氫還是用過氧化氫和Akt inhibitor共同處理細胞，過表達 TFEB-S467D均可以減少 SH-SHY5Y細胞凋亡。然而用 EGF激活Akt后，過表達TFEB-S467A不能抑制過氧化氫誘導

29、的SH-SHY5Y細胞凋亡。這些結果表明，Akt誘導的TFEB-S467磷酸化是阻抑過氧化氫誘導的SH-SHY5Y細胞凋亡所必須的。
　　2.Akt誘導的TFEB抑制過氧化氫引起的原代神經(jīng)元凋亡同時，我們也檢測了TFEB-S467磷酸化對過氧化氫誘導的原代神經(jīng)元凋亡的影響。用TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D感染小鼠原代神經(jīng)元細胞后，再用Akt inhibitor和過氧化氫處理細胞。Western blot結果顯

30、示，過表達 TFEB-S467D的細胞與過表達 TFEB-S467A的細胞相比，無論單獨給予過氧化氫還是用過氧化氫和Akt inhibitor共同處理細胞，PARP的活化均受到顯著抑制。與Western blot結果一致，流式細胞術分析結果也顯示，過表達TFEB-S467D可以顯著抑制由過氧化氫誘導的原代神經(jīng)元凋亡。這些結果顯示，Akt催化的TFEB-Ser467位點磷酸化對阻抑過氧化氫誘導的原代神經(jīng)元凋亡是必要的。
　　3.磷酸

31、化型TFEB可以保護多巴胺神經(jīng)元免受MPTP的損傷
　　已經(jīng)證明，MPTP通過誘導腦組織氧化應激而損傷多巴胺神經(jīng)元并導致帕金森癥。為了進一步探討TFEB-Ser467磷酸化是否可以保護多巴胺神經(jīng)元，我們給小鼠中腦注射TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D腺病毒，使其在腦組織過表達后，觀察TFEB-Ser467磷酸化對MPTP誘導的神經(jīng)元凋亡中的影響。酪氨酸羥化酶的免疫熒光染色結果顯示，與未注射的區(qū)域相比，過表達TFE

32、B和TFEB-S467D可以顯著增加酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元細胞的數(shù)量，說明細胞存活率增加。這些結果表明，在 MPTP誘導的小鼠中腦多巴胺神經(jīng)元損傷模型中，TFEB-Ser467位點磷酸化可以保護由MPTP誘導的多巴胺神經(jīng)元損傷。
　　小結:
　　1.Akt誘導的TFEB磷酸化抑制過氧化氫引起的SH-SHY5Y細胞和原代神經(jīng)元凋亡。
　　2.磷酸化型TFEB可以保護多巴胺神經(jīng)元免受MPTP的損傷。
　　結論：