宮內營養(yǎng)不良及早期GH干預對大鼠AMPK-α1-SREBP-1c-ACC-1通路的影響及機制.pdf

1、背景:
　　脂代謝紊亂是成人代謝綜合征發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，小于胎齡兒(SGA)與此密切相關。因此，尋找SGA患兒脂代謝異常的相關靶標，開展深入研究十分必要。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一種在真核細胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一個異源三聚體復合物，由α，β和γ三個亞基組成，α亞基又分為α1和α2催化亞基，其在肝臟脂質穩(wěn)態(tài)調節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前已經證實AMPK-α1的異常表達參與脂代謝紊亂的發(fā)生。但

2、SGA個體整個發(fā)育期肝臟組織AMPK-α1表達水平的動態(tài)變化規(guī)律以及其調控的脂肪酸代謝是否參與SGA大鼠成年期脂代謝紊亂的發(fā)生？尚未見報道。我們將從AMPK-α1及其調控的脂肪酸代謝關鍵靶基因固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)、乙酰輔酶A羧化酶-1（ACC-1）探討SGA大鼠成年期出現(xiàn)脂代謝紊亂的可能機制。此外，表觀遺傳修飾對SGA誘導的各類代謝疾病的發(fā)生起了重要作用，但目前很少有人關注AMPK-α1基因的表觀遺傳修飾與SG

3、A大鼠肝臟脂代謝的相關研究。近年來microRNAs（miRNAs）在脂質代謝中的作用受到密切關注，研究報道m(xù)iR-370通過miR-122間接影響AMPK、SREBP-1c和ACC-1的表達，從而調控脂類代謝，但在SGA模型中這兩個miRNA是否也參與對AMPK-α1、SREBP-1c及ACC-1基因的調控，有待進一步探討。
　　目前，AMPK已經成為肝臟脂質代謝紊亂治療的重要靶點之一。眾多研究已表明，SGA者早期應用生長激素(

4、GH)后的追趕生長可能對各項代謝參數均有益。外源性GH治療能恢復肝臟AMPK-α總蛋白及磷酸化水平，發(fā)揮調脂功能。在SGA群體中，GH能否同樣通過激活AMPK-α1影響其下游脂肪酸代謝相關基因從而達到早期預防成年期脂代謝紊亂發(fā)生？這將為今后指導臨床SGA患兒GH治療提供理論依據。
　　第一部分、宮內營養(yǎng)不良對大鼠脂代謝AMPK-α1/SREBP-1α/ACC-1通路的影響及機制
　　目的:
　　動態(tài)觀察SGA大鼠從出生

5、至成年期肝臟AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路、通路相關miRNA及組蛋白乙酰化修飾的變化，明確SGA大鼠脂代謝紊亂的分子機制。
　　方法:
　　采用孕鼠全孕程半饑餓法建立SGA大鼠模型。仔鼠在1天、21天和70天齡時分別測量體重和身長，留取血清及肝臟組織標本。采用酶法檢測血清甘油三酯(TG)水平和肝臟TG含量;Western blot測定肝臟組織AMPK-α1和細胞核內成熟的SREBP-1c(nSREBP-1

6、c)蛋白的表達水平;real-time RT-PCR測定肝臟組織AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表達水平;CHIP-PCR用于分析肝臟組織AMPK-α1基因組蛋白乙?；?采用miRNA芯片技術和生物信息學方法對1天齡AGA及SGA大鼠肝臟組織差異miRNAs進行分析篩選，并對篩選結果采用real-time RT-PCR進行驗證。
　　結果:
　　1.體重和身長比較:1天齡時SGA大鼠體重和身長均顯

7、著低于AGA大鼠(P均＜0.01);生后早期SGA大鼠出現(xiàn)生長追趕，以體重追趕為主，21天齡時體重與身長均未完全追趕上AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01）;至70天齡時體重與身長仍顯著低于AGA大鼠(P＜0.05)。
　　2.血清TG水平比較:1天和21天齡時SGA和AGA大鼠間血清TG水平均無統(tǒng)計學差異，70天齡時SGA大鼠血清TG水平明顯高于AGA大鼠（P＜0.05）。
　　3.肝臟TG含量比較:1天和21天齡時SG

8、A和AGA大鼠間肝臟TG含量均無統(tǒng)計學差異，70天齡時SGA大鼠肝臟TG含量顯著高于AGA大鼠（P＜0.05）。
　　4.各基因蛋白水平表達比較:1天齡時SGA和AGA大鼠間肝臟組織AMPK-α1和nSREBP-1c蛋白表達均無統(tǒng)計學差異;21天和70天齡時SGA大鼠肝臟組織AMPK-α1蛋白的表達均顯著低于AGA大鼠（P均＜0.05），nSREBP-1c蛋白的表達均顯著高于AGA大鼠（P均＜0.05）。
　　5.各基因mR

9、NA水平表達比較:1天齡時SGA和AGA大鼠間肝臟組織AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表達均無統(tǒng)計學差異;21天和70天齡時SGA大鼠肝臟組織AMPK-α1 mRNA的表達均顯著低于AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01），SREBP-1c mRNA的表達均顯著高于AGA大鼠（P均＜0.01），ACC-1mRNA的表達均顯著高于AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01）。
　　6.AMPK-α1基因組蛋白H3

10、乙?；奖容^:大鼠肝臟組織AMPK-α1基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；奖容^，1天齡時SGA與AGA大鼠間無統(tǒng)計學差異，21天和70天齡時SGA大鼠顯著低于AGA大鼠（P均＜0.01）。
　　7.miRNA差異表達譜分析:分析1天齡時AGA和SGA大鼠肝臟組織miRNAs的表達譜，在SGA組中表達上調＞1.3的miRNA有8個，表達下調＜0.75的miRNA有22個。
　　8.miRNA-370和miRNA-122表達比較

11、:1天齡時肝臟組織miR-122的表達，SGA與AGA大鼠間比較無統(tǒng)計學差異;miR-370的表達，SGA大鼠顯著低于AGA大鼠（P＜0.05），與芯片篩查結果一致。21天和70天齡時肝臟組織miR-122的表達，SGA與AGA大鼠間比較均無統(tǒng)計學差異;這兩個時間點miR-370的表達均無法檢測到。
　　結論:
　　1.母鼠孕期營養(yǎng)不良所致的子代生長遲緩可延續(xù)至生后早期甚至成年期。
　　2.SGA大鼠幼年期和成年期肝臟

12、脂代謝通路AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1發(fā)生改變，這一變化可能與成年期脂代謝紊亂的發(fā)生密切相關。
　　3.SGA大鼠幼年期和成年期肝臟AMPK-α1基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；矫黠@降低。
　　4.SGA大鼠出生時miR-370的表達明顯下降，該miRNA可能參與SGA大鼠胚胎期及新生兒期代謝的調控。
　　第二部分、早期GH干預對SGA大鼠脂代謝AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的影響及機

13、制
　　目的:
　　探究GH干預能否通過影響組蛋白乙?；揎棧{節(jié)肝臟AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的表達，改善SGA大鼠脂代謝紊亂。
　　方法:
　　采用前期建立的SGA大鼠模型，從大鼠21天齡斷奶時進行rhGH(5 mg/kg/day)干預至35天齡，對照組予等量生理鹽水每日同時腹腔注射，分組情況如下:SGA+rhGH組、SGA+NS組、AGA+rhGH組、AGA+NS組。測量大鼠體重和身長

14、，留取血清及肝臟組織標本。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清胰島素樣生長因子1（IGF-1）水平;采用酶法檢測血清TG水平和肝臟TG含量;Western blot測定肝臟組織AMPK-α1和nSREBP-1c蛋白的表達水平;Real-time RT-PCR測定肝臟組織AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表達水平;CHIP-PCR用于分析肝臟組織AMPK-α1基因組蛋白乙?；?對肝臟組織miRNA-122采用real-ti

15、meRT-PCR檢測。
　　結果:
　　1.體重和身長比較:干預后，21至70天齡期間SGA+rhGH體重與身長增長倍數均略高于AGA+NS組、AGA+rhGH組及SGA+NS組，但差異無統(tǒng)計學意義。成年期（70天齡）大鼠體重與身長，SGA+NS組顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P＜0.01和P＜0.05）;SGA+NGH、AGA+NS組和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。
　　2.血清IGF-1水平比

16、較:為探究rhGH腹腔注射是否有效應，測定了干預開始前21天齡，干預結束時35天齡及干預后成年期70天齡時大鼠血清IGF-1水平。干預開始前21天齡，血清IGF-1水平，SGA組明顯低于AGA組(P＜0.05)。干預結束時35天齡，血清IGF-1水平，SGA+NS組顯著低于SGA+rhGH組（P＜0.05），AGA+NS組略低于AGA+rhGH組，但差異不具統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預結束后成年期70天齡，血清IGF-1水平，各組間

17、無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。
　　3.血清TG水平比較:干預后，成年期（70天齡）大鼠血清TG水平，SGA+NS組顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。
　　4.肝臟TG含量比較:干預后，成年期（70天齡）大鼠肝臟TG含量，SGA+NS組顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS

18、和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。
　　5.各基因蛋白水平表達比較:干預后，成年期（70天齡）大鼠肝臟組織AMPK-α1蛋白水平的表達，SGA+NS組顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。大鼠肝臟組織nSREBP-1c蛋白水平的表達，SGA+NS組顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05），SGA+rhGH、AGA

19、+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。
　　6.各基因mRNA水平表達比較:干預后，成年期（70天齡）大鼠肝臟組織AMPK-α1 mRNA水平的表達，SGA+NS組顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。大鼠肝臟組織SREBP-1c和ACC-1 mRNA水平的表達，SGA+NS組均顯著高于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0

20、.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三組間均無統(tǒng)計學差異。
　　7.AMPK-α1基因組蛋白H3乙?；降谋磉_比較:干預后，成年期(70天齡)大鼠肝臟組織AMPK-α1基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；?，SGA+NS組均顯著低于AGA+NS組及SGA+rhGH組（P均＜0.05）;SGA+rhGH組略低于AGA+NS組及AGA+rhGH組，但差異均無統(tǒng)計學意義;AGA+NS組與AGA+rhGH組無統(tǒng)計學差異。