Dishevelled2通過交叉調控NF-κB通路對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)最主要的病理改變是滑膜炎，以滑膜細胞凋亡減少、腫瘤樣生長及炎性介質大量分泌為特征，繼而導致關節(jié)軟骨破壞及骨侵蝕，最終導致關節(jié)的不可逆破壞從而致殘。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocyte，FLS)是關節(jié)滑膜的重要組成部分，是上述病理過程的重要參與者。RA-FLS的激活與多條信號通路有關，其中最為經典的信號通路便是NF-κB信號通路。在RA-FLS

2、中，NF-κB通路被明顯激活后其下游靶基因(如cIAP1、cIAP2、IL-1，IL-6)的表達增加使得RA-FLS抗凋亡能力以及炎癥因子、粘附分子、基質降解酶的分泌能力明顯升高。除了NF-κB信號通路外，Wnt信號通路在RA中的作用也是近年來研究的熱點，有證據顯示Wnt信號通路在RA中也處于激活狀態(tài)，參與了RA-FLS的活化。巢亂蛋白(Dishevelled，Dvl)是處在Wnt信號通路中游的關鍵的信號蛋白分子，是非常重要而有趣的分子

3、。Dvl有三種的同型異構體(Dvl1，DVL2，Dvl3)和4個高度保守結構域(DIX域、PDZ域、DEP域以及DSV)。Dvl不僅是經典和非經典Wnt通路的分線器，也可以與其他信號通路上的幾十種蛋白相互作用，所以也是Wnt通路與BMP、mTOR等多條信號通路的交匯點。盡管在腫瘤中已經有一些關于Dvl蛋白的研究，但是目前在RA中還沒有關于Dvl蛋白表達及功能的相關研究。因此，本研究著重探討了DVL2在RA滑膜組織和RA-FLS中的表達情

4、況以及其對RA-FLS凋亡和炎癥因子分泌的影響和相關分子機制。
　　一、DVL2在類風濕關節(jié)炎滑膜組織及RA-FLS中處于高表達狀態(tài)
　　首先，我們與關節(jié)外科合作，獲取了RA、骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)及正常創(chuàng)傷(Trauma)患者的滑膜組織，通過免疫組織化學(IHC)、蛋白質印記(WB)等方法檢測了DVL2蛋白的表達情況。結果發(fā)現盡管DVL2蛋白的表達在RA與OA中沒有顯著差異，但是RA滑膜組織中的DV

5、L2蛋白表達量明顯高于Trauma患者，提示DVL2可能通過Wnt通路參與RA滑膜的增殖。另外，從滑膜組織中提取原代FLS后進行檢測，結果同樣顯示DVL2在RA-FLS中的表達高于Trauma-FLS?；そM織的IHC和RA-FLS的免疫熒光檢測結果顯示DVL2在FLS的細胞質和細胞核中均有表達。
　　二、DVL2在體內可促進RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌
　　在明確了DVL2在RA滑膜組織和RA-FLS中呈高表達狀

6、態(tài)后，為了對其功能做進一步的研究，我們建立了膠原誘導關節(jié)炎大鼠(CIA)模型，并構建了人源DVL2慢病毒過表達質粒(LV-DVL2)，包裝成慢病毒后注入CIA大鼠膝關節(jié)中。待DVL2過表達后觀察大鼠膝關節(jié)滑膜、軟骨、及軟骨下骨的變化，并對關節(jié)滑膜細胞凋亡及炎癥因子分泌情況進行檢測。有趣的是，DVL2在CIA大鼠膝關節(jié)中過表達后非但沒有使滑膜增殖進一步加重，反而一定程度上抑制了滑膜炎并對關節(jié)起到了一定的保護作用。對大鼠的關節(jié)滑膜和全膝關節(jié)

7、進行病理檢查發(fā)現DVL2可以減輕CIA大鼠滑膜炎;通過對大鼠膝關節(jié)腔內的關節(jié)液進行ELISA檢測發(fā)現DVL2可減少CIA大鼠膝關節(jié)內IL-1β、IL-6及IL-8的分泌;Micro-CT檢測結果顯示DVL2可以減輕CIA大鼠軟骨下骨的破壞;但是番紅O-固綠染色并未觀察到DVL2可以明顯減輕CIA大鼠關節(jié)軟骨破壞。進一步的TUNEL檢測結果顯示DVL2可以明顯增加CIA大鼠膝關節(jié)滑膜的凋亡，提示DVL2除了可能參與RA滑膜的增殖以外，還可

8、以在體內調控滑膜細胞的凋亡。
　　三、DVL2在體外也可促進RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌
　　為了進一步研究DVL2在RA中的功能及可能的作用機制，我們提取了人源的RA-FLS細胞并在其中過表達了DVL2基因，然后進行高通量mRNA測序，結果發(fā)現NF-κB通路及TNF通路都出現了明顯的下調。因此，我們將DVL2在RA-FLS中過表達后觀察其對RA-FLS細胞活性、凋亡、周期以及炎癥因子分泌的影響。結果發(fā)現在體外過表

9、達DVL2的RA-FLS細胞活性明顯下降，在加入TNF-α刺激后這一現象更為明顯;進一步對RA-FLS的凋亡及細胞周期進行檢測，結果發(fā)現DVL2可以明顯增加RA-FLS凋亡率并對細胞周期造成一定的影響;用ELISA方法對細胞上清進行檢測發(fā)現，DVL2可減少RA-FLS分泌的IL-1β、IL-6及IL-8;而這一抑制作用也在加入TNF-α刺激后同樣變得更為明顯。提示DVL2在炎性環(huán)境下可以抵消一部分炎癥反應，從而一定程度上遏制RA-FLS

10、的無限增殖。
　　四、DVL2通過抑制NF-κB通路影響RA-FLS凋亡和炎癥因子的分泌
　　結合上述結果，我們推測DVL2可以抑制RA-FLS的增殖及炎癥因子的分泌很有可能是通過抑制NF-κB通路進而抑制其調控基因實現的。因此，我們首先通過RT-PCR對mRNA測序所得的差異基因進行驗證，結果發(fā)現DVL2在RA-FLS中過表達后可以抑制抗凋亡基因A20、GADD45β、和cIAP2的表達，而對cIAP1的表達卻沒有明顯的影

11、響;當給予TNF-α刺激后再次對其進行了檢測，RT-PCR結果顯示DVL2對A20、cIAP1和cIAP2的表達起到顯著的抑制作用，但對GADD45β的表達卻沒有明顯的影響;DVL2在RA-FLS細胞中過表達后IL-6基因表達明顯下調，而IL-1β及IL-8的基因表達卻沒有明顯變化;給予TNF-α刺激后DVL2則可明顯抑制RA-FLS中IL-1β、IL-6以及IL-8基因的表達。因為上述抗凋亡基因和炎癥因子基因均可被NF-κB通路調控，

12、所以我們推斷DVL2是通過抑制NF-κB通路實現上述功能的。那么DVL2是如何抑制NF-κB通路的呢？首先我們通過Flowsight檢測發(fā)現DVL2在RA-FLS中可以抑制P65的入核;通過IP檢測發(fā)現DVL2在RA-FLS中也可以與P65相互作用，通過ChIP檢測發(fā)現DVL2與P65相互作用后可以抑制P65與上述靶基因啟動子的結合，從而減少抗凋亡基因和炎癥因子基因的表達。
　　綜上所述，本研究從臨床滑膜標本的采集到原代細胞的培養(yǎng)

13、，從體內動物實驗到體外細胞實驗再到基因層次的改造，全面系統(tǒng)的研究了DVL2在RA患者關節(jié)滑膜原代細胞中的表達情況以及DVL2在體內體外對RA-FLS增殖及炎癥因子分泌的影響。除了觀察現象我們還利用mRNA-seq、IP、Flowsight、ChIP等方法對DVL2的作用機制進行了深入研究。發(fā)現雖然DVL2在RA滑膜中處于高表達狀態(tài)，可能參與了滑膜的腫瘤樣生長，但是DVL2也可以促進RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌。而DVL2之所以