鎘脅迫下水稻和油菜中microRNA的克隆、鑒定與miR395功能分析.pdf

1、microRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一類調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達的非編碼的小分子RNAs(small RNA,sRNA)。迄今為止,人們通過生物信息學和實驗方法分離和鑒定到了大量的 miRNA,并登錄在 miRNA數(shù)據(jù)庫中(http://www.sanger.ac.uk/)。鎘已經(jīng)成為我國農(nóng)田中有毒重金屬污染的主要來源之一,它在植物中積累會破壞細胞功能,影響植物生長和發(fā)育。植物對重金屬脅迫有不同的響應(yīng),其中很顯著的就是,植物根系硫同化以及

2、與谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因表達上調(diào)。最近,越來越多的研究揭示了一些miRNA在各種非生物脅迫(如干旱、低溫和機械力等)中的調(diào)控機制,然而對于不同物種中響應(yīng)重金屬脅迫的miRNA的研究甚少。
　　 水稻(Oryza sativa)是世界一種非常重要的糧食作物,而且水稻的全基因組測序已經(jīng)完成,這為我們挖掘到更多的與重金屬脅迫相關(guān)的miRNA提供了基礎(chǔ)。為了獲得新的響應(yīng)脅迫的miRNA,我們構(gòu)建了一個經(jīng)80μM CdCl2處理的水稻(日

3、本晴)sRNA文庫。在文庫中一共克隆到19個新的miRNA,均屬于水稻特有的miRNA,分屬于6個不同的家族。我們還克隆到10個水稻已知的miRNA,其中9個為植物中保守序列,另1個屬于水稻特有的miRNA。另外,在此文庫中我們還發(fā)現(xiàn)56個不同的其它內(nèi)源性非編碼sRNA。對新發(fā)現(xiàn)miRNA進行了靶基因的預(yù)測后,得到了34個潛在的基因。進一步檢測這6個新發(fā)現(xiàn)的miRNA家族和10個已知的miRNA在鎘、銅、鋁脅迫下的表達,發(fā)現(xiàn)他們有不同的

4、表達模式。其中,miR602與其靶基因木葡聚糖內(nèi)酰基轉(zhuǎn)移酶(xyloglucan endotransglycosylase,XET)以及miR604與其靶基因脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(lipid transfer protein,LTP)都存在負調(diào)控關(guān)系。這些功能有待于做進一步的鑒定。
　　 油菜(Brassica napus)是世界第三大的油料作物。我們在油菜缺硫與重金屬鎘脅迫文庫中克隆到5個新的保守miRNA,同時還克隆到2個與miR3

5、95相關(guān)的硫代謝響應(yīng)基因:BnAPS3(FJ626851)和BnAPS4(FJ626850)。通過生物信息學和5’RACE實驗方法確認了4個miR395的靶基因:BnSultr2；1,BnAPS1,BnAPS3和BnAPS4。此外,分析了miR395與其靶基因在缺硫脅迫和鎘脅迫下的表達模式。鎘脅迫和缺硫脅迫均能誘導miR395表達量增加,但其4個靶基因表現(xiàn)出不同的表達模式。將擬南芥395d前體轉(zhuǎn)入到油菜之中,發(fā)現(xiàn)靶基因表達被抑制,其表皮

6、毛缺失和發(fā)育延時等表型變化。
　　 目前研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有6個miR395的位點,調(diào)控4個不同的與硫代謝相關(guān)的靶基因。為了深入研究miR395調(diào)控功能,我們構(gòu)建了擬南芥miR395c和miR395e前體的過表達植株,再利用Slim突變體和Mimic395轉(zhuǎn)基因植株分析了它們在正常和缺硫脅迫下的調(diào)控模式.在硫脅迫下,miR395表達量增加,ATPS1表達基本不變,ATPS4表達顯著下調(diào),SULTR2;1表達上升。相對于野生型Col

7、-0,miR395過表達植株的靶基因表達量明顯下降,而Mimic395轉(zhuǎn)基因植株在兩種條件下的表達均有所增加。為了揭示在缺硫脅迫下,SULTR2;1的表達與miR395表達同時增加的非負調(diào)控現(xiàn)象,我們構(gòu)建了將SULTR2；1基因與其自身啟動子和GFP蛋白融合(SULTR2;1PRO::SULTR2；1:GFP)的轉(zhuǎn)基因植株。此外,我們還構(gòu)建了SULTR2；1與miR395互補位點點突變的植株(SULTR2；1PRO::SULTR2;1m