新型吡唑啉衍生物抑制肺癌A549細胞生長的機制研究.pdf

1、研究背景和研究目的：
　　目前癌癥是除心臟病和腦血管病變以外的世界三大疾病之一，而在百余種不同病變的痛癥中，至今尚未發(fā)現(xiàn)有特效的治療方法。肺癌因其發(fā)現(xiàn)晚，高致死率在癌癥治療中成為一個全球性難題，而環(huán)境因素尤其是大氣污染和不良生活習慣如抽煙也加劇了這一病癥的發(fā)展。在所有類型的肺癌中，非小細胞肺癌占據比重高達85％，大概四分之三的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，且5年存活率極低。目前除了手術切除外，化療依舊是治療肺癌必不可少的手段。但化療藥物

2、副作用較大，病人化療過程十分痛苦。因此亟需開發(fā)新的抑制腫瘤生長及發(fā)展的化合物。
　　目前化合物抑制腫瘤生長的作用主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細胞增殖和遷移及誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡等。抑制腫瘤增殪主要是通過阻滯細胞周期來實現(xiàn)的，利用化療藥物抑制細胞內DNA復制，將細胞周期阻滯在G0/G1期，從而阻止細胞分裂，達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。惡性腫瘤難以治愈的一個顯著特點就是其高轉移特性，腫瘤細胞實現(xiàn)這一生理過程主要依賴于細胞遷移，因此，抑制腫瘤細胞

3、遷移也是治療腫瘤的有效手段。
　　自噬是哺乳動物中普遍存在的機制，這一保守過程在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用，在多種人類疾病，如神經退行性疾病、免疫失調、心血管疾病、糖尿病尤其是癌癥中都發(fā)現(xiàn)不同程度的自噬失調。研究表明在多種癌癥發(fā)生中都存在自噬相關基因不同程度的缺失。細胞凋亡即程序性細胞死亡，誘發(fā)癌細胞凋亡是很多抗癌藥物作用的經典方式，而且自噬與凋亡關系密切，過度的自噬最終會誘導細胞凋亡。因此研究腫瘤細胞的自噬和凋亡的相互關

4、系和作用，對于尋找腫瘤治療的新靶點，建立腫瘤治療的新策略都具有指導意義?；瘜W遺傳學利用具有細胞滲透性的化學小分子為研究工具，廣泛應用在探究細胞信號通路和細胞內穩(wěn)態(tài)維持中。化學小分子因其化學結構簡單，易于進細胞并且具有作用可逆等優(yōu)點已廣泛應用于基因表達水平調控，信號通路轉導以及免疫研究等領域。研究小分子化合物作用機制能為藥物開發(fā)提供先導化合物，從而縮短抗癌藥物開發(fā)過程，推動腫瘤治療進程。
　　綜上所述，本研究旨在運用化學遺傳學手段，

5、篩選能夠有效抑制腫瘤細胞生長的化學小分子，并進一步探究其抑制腫瘤細胞生長的具體機制，尋找小分子胞內作用靶點，以期發(fā)現(xiàn)新的治療腫瘤的分子靶點，建立高效的腫瘤治療機制。
　　研究內容：
　　1.篩選能夠抑制A549細胞生長的化學小分子;
　　2.探究化學小分子在細胞內的分布;
　　3.研究化學小分子在細胞水平及組織水平的作用效果;
　　4.研究化學小分子抑制A549細胞生長的分子機制;
　　研究方法：

6、r>　　1.A549及HUVECs細胞的培養(yǎng);
　　2.倒置熒光顯微鏡觀察A549細胞形態(tài)變化;
　　3.SRB法檢測細胞存活率;
　　4.AO染色檢測細胞核斷裂情況;
　　5.LDH法檢測細胞是否壞死;
　　6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察LC3點狀聚集情況;
　　7.免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ及mTOR的下游底物4EBP1，p70S6K的磷酸化水平變化;
　　8.RNA干擾研究化學小

7、分子抑制mTOR活性的作用機制;
　　9.免疫熒光法檢測mTOR，LC3與化學小分子共定位情況;
　　10.激光掃描共聚焦顯微鏡檢測小分子化合物在細胞中的亞定位;
　　11.免疫印跡法檢測化合物對p21和p27的水平影響;
　　12.流式細胞術分析細胞周期分布;
　　13.雞胚尿囊膜實驗檢測化學小分子體內腫瘤抑制效果。
　　研究結果：
　　1.化學小分子5a-5i的處理引起A549形態(tài)變得不規(guī)則

8、;
　　2.化學小分子5a-5i能顯著抑制A549細胞增殖，但對正常細胞HUVECs生長無影響;
　　3.化學小分子5a-5i短時間處理不引起A549細胞凋亡;
　　4.除化合物5f外，其他化學小分子不誘導A549細胞壞死;
　　5.化學小分子5a-5i誘導細胞自噬;
　　6.化合物5e誘導mTOR依賴的完整自噬流;
　　7.化合物5e通過FKBP12抑制mTOR的活性;
　　8.化學小分子5a

9、-5i具有良好的熒光特性，5e與溶酶體共定位;
　　9.化合物5e抑制體內腫瘤生長并且不影響正常血管生成;
　　10.化合物5e誘導實體瘤內腫瘤細胞凋亡;
　　11.化學小分子5a-5i能阻滯A549細胞周期;
　　12.化合物5e抑制A549細胞遷移。
　　結論：
　　1.化學小分子以濃度和時間依賴的方式抑制A549細胞增殖，其中化合物5e，5g，5h效果較好。
　　2.化合物在短時間內誘導細