二聚化蜘蛛拖絲蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、為了制備可用于蜘蛛拖絲蛋白體外檢測(cè)的抗血清,本研究利用研究室前期工作中獲得的、根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)的二聚化蜘蛛拖絲蛋白基因構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒2S-pET-52b(+),并且通過(guò)原核表達(dá)的方式得到大量重組蜘蛛拖絲蛋白2S-His,對(duì)此重組蛋白進(jìn)行His標(biāo)簽特異性的親和純化,并以純化后蛋白作為抗原,在佐劑的輔助下對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫。研究所得結(jié)果:
　　 (1)原核表達(dá)載體構(gòu)建:以2S-UHS-3.1為模板擴(kuò)增得到含有蜘蛛拖

2、絲蛋白二聚體基因的PCR產(chǎn)物片段;此PCR片段與線性載體pEasy-3.1相連,得到重組質(zhì)粒2S-pEasy-3.1;利用引物引入酶切位點(diǎn)和pEasy-3.1載體本身酶切位點(diǎn)對(duì)重組質(zhì)粒中2S兩端進(jìn)行特異性酶切,后將酶切所得2S片段與pET-52b(+)表達(dá)載體相連,最終得到可用于原核表達(dá)的重組質(zhì)粒2S-pET-52b(+)。
　　 (2)重組蛋白的表達(dá)和純化:將重組質(zhì)粒2S-pET-52b-(+)轉(zhuǎn)化入表達(dá)型感受態(tài)BL21-PL

3、ysS中,篩選得到表達(dá)狀況最佳的菌株;對(duì)此菌株的表達(dá)條件進(jìn)行摸索,最終得到重組蛋白2S-His原核表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度,溫度及時(shí)間條件。對(duì)重組蛋白進(jìn)行His標(biāo)簽特異性的親和純化,得到可用于制備多克隆抗體的純化后蛋白。
　　 (3)抗體制備:純化后的2S-His蛋白經(jīng)SDS-PAGE后切膠與佐劑混合乳化,用混合物對(duì)四只健康新西蘭大白兔進(jìn)行多點(diǎn)皮下免疫,經(jīng)過(guò)三次免疫后兩只兔子的抗血清經(jīng)Elisa檢測(cè)效價(jià)比較理想,其中,最高效價(jià)