基于RNA-Seq的哮喘小鼠氣管平滑肌組織轉錄組分析及小鼠氣管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，由于其發(fā)病原因的復雜性，目前仍不是十分清楚它的發(fā)病機制。哮喘患者的氣管平滑肌會發(fā)生大量的增殖，從而導致氣道狹窄。了解哮喘發(fā)生時氣管平滑肌增殖的原因也是了解哮喘的途徑之一。本文主要是研究在急性與慢性哮喘模型小鼠與其相應正常小鼠的氣管平滑肌組織中的轉錄組學差異，從中發(fā)現(xiàn)與急慢性哮喘有關的基因。同時檢測KDM2A基因在急性、慢性哮喘小鼠氣管平滑肌組織中RNA和蛋白的表達情況，并通過改良的組織塊貼壁法建立氣管平滑肌

2、的原代細胞。
　　本研究主要內容包括：⑴分離急性與慢性哮喘模型小鼠與其相應對照小鼠的氣管平滑肌組織，用于RNA-Seq測速分析，然后在篩選出急性與慢性哮喘模型小鼠中的差異表達基因之后，應用生物信息學方法，包括GO功能顯著性富集分析、KEGG信號通路網絡分析與Pathway顯著性富集分析等詳細深入的分析方法，對這些篩選出的差異表達基因進行功能、細胞組分分布與所述信號通路的分類。最終確定與急性與慢性哮喘有關的預警基因。其次，通過Rea

3、l-time PCR及Western blotting檢測KDM2A基因在急性、慢性小鼠氣管平滑肌組織中RNA及蛋白質的表達。在這同時，還進行了急性、慢性小鼠肺組織的切片、HE染色及免疫組化。最后，運用改良后的組織塊貼壁法建立了氣管平滑肌的原代細胞，并用MTT法測量了氣管平滑肌原代細胞的生長曲線。⑵在RNA-Seq測序分析中，急性哮喘模型小鼠與急性對照小鼠對比共篩選出相關候選基因2429個，其中上調基因1635個，下調基因794個；通過

4、對慢性哮喘模型小鼠和慢性對照小鼠的基因進行對比，篩選出相關候選基因13537個，其中上調基因6681個，下調基因6856個。這些基因分別分布在細胞膜、內質網、外泌體和著絲粒上。另外分子生物學實驗也證明KDM2A在急性與慢性哮喘平滑肌中的表達含量要比正常組小鼠要低，而且慢性哮喘組的小鼠比急性哮喘組的小鼠還要低。使用組織塊貼壁法所培養(yǎng)出的原代培養(yǎng)氣管平滑肌細胞，3天后細胞就可爬出，一周內即可傳代。經純化后，可以得到純度較高的氣管平滑肌原代細

5、胞，且細胞的生長狀況良好。⑶根據測序所得的分析結果，可以得知相對于正常小鼠，急性與慢性哮喘小鼠氣管平滑肌中有許多基因是有差異表達的。而且慢性哮喘小鼠中的差異表達基因更多一些。分子生物學實驗表明KDM2A可能是在小鼠氣管平滑肌細胞中起到降低細胞增殖速率的作用，在急性與慢性哮喘小鼠的氣管平滑肌當中，正是由于KDM2A表達量的降低才導致了氣管平滑肌細胞的過度增殖，才導致氣管平滑肌的過度增殖、氣道的狹窄與氣道重塑。改良后的組織塊貼壁法可以在短時