利用Crispr-Cas9技術在CHO細胞和HEK293T細胞中敲除DNMT3a基因及在CHO細胞中定點整合CTLA4Ig基因.pdf

1、背景和目的：
　　Crispr（Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats）稱為規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列，最初發(fā)現(xiàn)于多種古生物與細菌基因組中，被認為與其免疫系統(tǒng)相關。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Crispr可用于基因工程，并將其開發(fā)成為一種強大的基因編輯技術。與早些年興起的基因編輯技術鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應因子核酸酶（TALENs）相比，Cris

2、pr/Cas9系統(tǒng)操作更簡單，所需時間少，編輯效率高且成本更低，因此近年來逐漸成為主流的基因編輯技術。在本文中，我們采用Crispr/Cas9系統(tǒng)在工程細胞株中華倉鼠卵巢細胞(CHO)和人胚胎腎細胞(HEK293T)中進行靶向的基因編輯，并取得了成功。
　　目前市場上有一半以上的治療用重組蛋白藥物都是通過哺乳動物細胞表達系統(tǒng)進行生產(chǎn)，但哺乳動物細胞株存在不穩(wěn)定性，隨著培養(yǎng)時間的延長，有的細胞株產(chǎn)量會顯著降低。研究表明這種不穩(wěn)定性有

3、可能和細胞的表觀遺傳學修飾有關，特別是DNA的甲基化。目前在哺乳動物細胞中，已發(fā)現(xiàn)有三種控制DNA甲基化的酶，我們選擇了其中一種，即DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）進行研究，通過Crispr/Cas9技術將控制此酶表達的基因敲除，并初步研究了該基因被敲除后細胞株的生長特性及外源蛋白的表達情況。
　　另一方面，目前構(gòu)建重組細胞株的方法主要是隨機整合的方式，而這種隨機整合的細胞株由于無法控制目的基因在基因組中插入的位置，會造成稱之

4、為“位置效應”的問題，為克服此種情況的發(fā)生，學者紛紛轉(zhuǎn)向在基因組中定點整合目的基因。由于Crispr/Cas9技術的獨特優(yōu)勢，有很多研究開始嘗試利用其進行細胞基因組中目的基因的定點插入。在本文中，我們就利用Crispr技術在CHO細胞的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（FUT8）基因座中定點插入了細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（CTLA4Ig）基因。
　　方法：
　　在CHO細胞和HEK293T細胞中敲除DNMT3a基因：針對CHO細胞和HEK29

5、3T細胞DNMT3a蛋白的關鍵作用位點設計兩對短向?qū)NA（sgRNA），構(gòu)建成功后將兩對sgRNA共轉(zhuǎn)染到相應的細胞中，然后用有限稀釋法在96孔板中鋪單克隆并篩選到基因敲除的單克隆細胞株。用綠色熒光蛋白（GFP）作為模式蛋白來驗證在DNMT3a基因敲除的細胞株中，外源蛋白的轉(zhuǎn)染及表達與野生型細胞是否具有差異。
　　在CHO細胞FUT8基因座中定點整合CTLA4Ig基因：在FUT8基因的起始密碼子ATG附近設計五對sgRNA，然后

6、挑選效率最高的兩對sgRNA，將其連同構(gòu)建的供體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細胞，經(jīng)過加藥篩選后，用有限稀釋法鋪單克隆培養(yǎng)板，挑取單克隆并進行檢測，成功得到CTLA4Ig基因定點整合的細胞株。
　　結(jié)果：
　　在CHO細胞和HEK293T細胞中敲除DNMT3a基因：最終通過有限稀釋法篩選得到了一株DNMT3a基因完全敲除的CHO細胞株（后面簡稱DNMT3a-CHO）和一株DNMT3a基因完全敲除的
　　HEK293T細胞株（后面

7、簡稱DNMT3a-HEK293T）。應用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（UMS）對細胞全基因組的胞嘧啶甲基化情況進行分析，結(jié)果表明相比于野生型CHO細胞（后面簡稱
　　WT-CHO），DNMT3a-CHO細胞基因組甲基化胞嘧啶的含量降低了27％，而DNMT3a-HEK293T細胞基因組中甲基化的胞嘧啶含量要比野生型的HEK293T細胞（后面簡稱WT-HEK293T）降低了22%。在生長性質(zhì)方面，DNMT3a-CHO和WT-C

8、HO生長特性無顯著差異，而DNMT3a-HEK293T較WT-HEK293T倍增時間延長。應用GFP作為模式蛋白驗證在DNMT3a基因敲除的細胞株中，外源蛋白的產(chǎn)量是否得到了提高，結(jié)果表明在CHO細胞中，敲除DNMT3a基因?qū)FP的表達量沒有顯著影響，而在HEK293T細胞中，敲除DNMT3a基因則會顯著減少GFP的單位表達量。
　　在CHO細胞FUT8基因座中定點整合CTLA4Ig基因：所設計的5條sgRNA編輯效率從17.7