烏司他丁下調(diào)LPS誘導的小鼠巨噬細胞MiR-21表達及初步調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：
　　探討烏司他丁在脂多糖誘導的RAW264.7細胞的保護作用及對miR-21表達影響。
　　方法：
　　(1)用不同濃度（100,250,500ng/mL）LPS刺激RAW264.7細胞，RT-PCR法檢測miR-21的表達、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）mRNA、白介素-6（interleukin-6,IL-6）mRNA的表達；
　?。?）采用500ng/

2、mL LPS刺激RAW264.7細胞6h、12h、24h，采用RT-PCR檢測TNF-α mRNA；
　?。?）四甲基偶氮唑(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測不同濃度（10,100,1000U/mL）UTI對RAW264.7細胞活性的影響；設(shè)置正常組、模型組（LPS500ng/mL剌激組）、實驗組（LPS500ng/mL+UTI1000U/mL組）和陰性實驗對照組（UTI1000U/mL），

3、觀察RAW264.7細胞生長狀態(tài)；
　?。?）用不同濃度(10,100,1000U/mL) UTI預(yù)處理2h后，LPS刺激小鼠RAW264.7細胞誘導炎癥模型，RT-PCR檢測腫瘤壞死因子TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、miR-21的表達，Western Blot法檢測UTI(1000U/mL)時PTEN蛋白表達水平。
　　(5)設(shè)置空白組、模型組（LPS500ng/mL剌激組）、實驗組（LPS+miR-21模擬劑、

4、LPS+miR-21抑制劑組）：RT-PCR法檢測miR-21的表達，Western Blot法檢測PTEN蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.UTI對細胞的保護作用
　　○1UTI對RAW264.7細胞的毒性作用:UTI濃度小于1000U/mL時對RAW264.7細胞無毒性作用，各組細胞OD值比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.117);○2.不同濃度(10,100,1000U/mL) UTI能有效降低TNF-αmRNA表

5、達及IL-6 mRNA表達(P1＜0.05, P2＜0.05)。
　　2.不同LPS濃度下TNF-αmRNA、IL-6mRNA及miR-21的表達情況
　　與正常組相比，在LPS（100,250,500ng/mL）刺激RAW264.7細胞后，miR-21、TNF-αmRNA及IL-6 mRNA的分泌量與基礎(chǔ)分泌量相比均明顯升高（P＜0.05），并隨LPS濃度升高而增加(P＜0.05)。
　　3.UTI對miR-21表達

6、的影響
　　不同濃度(10,100,1000U/mL) UTI能有效降低miR-21的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.miR-21對PTEN蛋白表達的影響
　　與空白組相比較，在LPS組中，miR-21表達上調(diào)，PTEN蛋白表達下調(diào)；在加入.miR-21抑制劑組中，miR-21表達明顯下降，PTEN蛋白表達明顯升高；miR-21模擬劑組中，miR-21表達明顯升高，PTEN蛋白表達明顯下降（P＜0.0

7、5）。
　　5.UTI對PTEN蛋白表達的影響
　　基于上述UTI下調(diào)miR-21表達水平的實驗結(jié)果，進一步觀察UTI對miR-21靶基因PTEN蛋白的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，PTEN蛋白表達水平在LPS組中明顯下降，在UTI組中表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.UTI可降低LPS誘導的RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6 mRNA的表達。
　　2.