內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS活化巨噬細胞的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由感染因素引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，是嚴重燒傷、創(chuàng)傷的常見并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導致多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfuction syndrome，MODS)和膿毒性休克(septicshock)，嚴重威脅患者生命。革蘭陰性菌外膜中的主要成分內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)是膿

2、毒癥的主要病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。LPS與其模式識別受體TLR4(Toll like receptor4)結合后可啟動MyD88依賴和TRIF/TRAM依賴的兩條信號轉(zhuǎn)導通路，活化單核/巨噬細胞，激活炎癥因子的轉(zhuǎn)錄與釋放，導致炎癥反應，過度的炎癥反應可誘導膿毒癥的發(fā)生。
　　 內(nèi)化(internalization)是指細胞通過胞吞作用將胞外物

3、質(zhì)轉(zhuǎn)運入胞內(nèi)的過程。LPS-TLR4復合物內(nèi)化入胞進入早期內(nèi)體，然后通過晚期內(nèi)體運送至溶酶體降解代謝，這一過程伴隨著內(nèi)體的酸化成熟。近期研究表明，LPS的內(nèi)化與其對細胞的活化密切相關，本課題組前期研究結果也顯示，內(nèi)化抑制后，LPS刺激巨噬細胞活化的程度明顯降低；內(nèi)體酸化成熟障礙可抑制巨噬細胞的活化，對炎癥反應具有抑制作用，但機制尚不明確。同時還觀察到CQ預處理抑制內(nèi)體酸化成熟后內(nèi)化的LPS-TLR4共定位消失，這與以往的認知相悖，而這一

4、現(xiàn)象與LPS內(nèi)化和活化細胞的關系及機制不明確。
　　 因此，本研究旨在探討內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS活化巨噬細胞的調(diào)控作用及機制，為進一步深入研究LPS內(nèi)化與細胞活化的關系及病理生理機制奠定基礎。
　　 目的
　　 應用內(nèi)體酸化成熟抑制劑氯喹(Chloroquine，CQ)抑制RAW264.7細胞內(nèi)體酸化成熟，研究內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS活化巨噬細胞的調(diào)控作用及機制。
　　 方法
　　 1.內(nèi)體酸化

5、成熟障礙對LPS活化RAW264.7細胞的調(diào)控作用的研究
　　 (1)CQ(20μg/ml)預處理RAW264.7細胞1h，LPS(100ng/ml)刺激24h后收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測TNF-α和IL-6在蛋白水平的表達情況。
　　 (2)采用siRNA技術抑制RAW264.7細胞MyD88、TRAM的表達，LPS(100ng/ml)刺激24h后收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測TNF-α和IL-6蛋白水

6、平的表達情況。
　　 (3)小鼠炎癥細胞因子抗體芯片技術檢測CQ預處理及siRNA干擾MyD88、TRAM后細胞上清中炎癥介質(zhì)總體的分泌情況，并進行對比分析。
　　 2.內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS活化RAW264.7細胞的調(diào)控作用的機制研究
　　 (1)CQ預處理后LPS-TLR4復合物共定位消失現(xiàn)象的研究
　　 ①利用CQ(20μg/ml)及另一內(nèi)體酸化成熟抑制劑-氯化銨(500μg/ml)抑制RAW26

7、4.7細胞內(nèi)體酸化成熟，F(xiàn)ITC-LPS(200ng/ml)刺激1h，激光共聚焦顯微鏡觀察FITC-LPS與Cy3-TLR4在胞內(nèi)的共定位情況。
　　 ②CQ(20μg/ml)抑制RAW264.7細胞內(nèi)體酸化成熟后，6FAM-CpG DNA(100ng/ml)刺激30min，激光共聚焦顯微鏡觀察6FAM-CpG DNA與Cy5-TLR9在胞內(nèi)的共定位情況。
　　 ③動態(tài)觀察內(nèi)體酸化成熟障礙后LPS與TLR4在胞內(nèi)的共定位

8、情況
　　 TLR4：：YFP標記質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察。CQ預處理后于不同時相點觀察LPS-TLR4的胞內(nèi)分布情況。
　　 ④內(nèi)體酸化成熟障礙對內(nèi)體循環(huán)相關調(diào)控分子表達的影響
　　 LPS(100ng/ml)刺激CQ(20μg/ml)預處理1h后的RAW264.7細胞，4h后，提取細胞總RNA，Real time PCR法檢測內(nèi)體循環(huán)關鍵分子Rab7b、Rab10、Rab11a在核酸水平

9、的表達情況。
　　 (2)內(nèi)體酸化成熟障礙對炎癥負調(diào)控分子表達的影響
　　 LPS(100ng/ml)刺激CQ預處理1h后的RAW264.7細胞，4h后，提取細胞總RNA，Real time PCR法檢測負調(diào)控分子A20、Tollip及MyD88s在核酸水平的表達情況。
　　 結果
　　 1.內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS活化RAW264.7細胞的調(diào)控作用的研究
　　 (1)CQ預處理1h，LPS刺激后

10、TNF-α和IL-6蛋白水平的表達被顯著抑制。
　　 (2)siRNA技術抑制RAW264.7細胞MyD88、TRAM的表達后，TNF-α和IL-6的表達均被顯著抑制。且MyD88表達抑制時，TNF-α的降低水平較IL-6的更顯著，TRAM表達抑制時，IL-6的降低水平較TNF-α的更顯著。
　　 (3)小鼠炎癥因子芯片結果顯示CQ預處理后炎癥因子的變化與MyD88和TRAM表達被抑制時的變化趨勢較一致。
　　

11、2.內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS活化RAW264.7細胞調(diào)控作用的機制研究
　　 (1)CQ預處理后LPS-TLR4復合物共定位消失現(xiàn)象的研究
　　 ①CQ及氯化銨預處理抑制RAW264.7細胞內(nèi)體酸化成熟，F(xiàn)ITC-LPS刺激1h后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)FITC-LPS與Cy3-TLR4在胞內(nèi)共定位呈現(xiàn)的黃色熒光消失，綠色和紅色熒光在胞內(nèi)散在分布，提示LPS-TLR4共定位消失。
　　 ②CQ預處理抑制RAW2

12、64.7細胞內(nèi)體酸化成熟，6FAM-CpG DNA刺激30min后，激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示6FAM-CpG DNA與Cy5-TLR9在胞內(nèi)共定位呈現(xiàn)的黃色熒光消失，綠色和紅色熒光在胞內(nèi)散在分布，提示CpG DNA-TLR9共定位消失。
　　 ③動態(tài)觀察內(nèi)體酸化成熟障礙后LPS與TLR4在胞內(nèi)的共定位情況
　　 TLR4：：YFP標記質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞未獲成功。
　　 CQ預處理后激光共聚焦顯微鏡觀察不

13、同時相點LPS-TLR4的胞內(nèi)分布，結果顯示共定位的FITC-LPS與Cy3-TLR4呈現(xiàn)的黃色熒光逐漸減少，40min時已完全看不到黃色熒光，而是綠色和紅色熒光在細胞內(nèi)散在分布。
　　 ④內(nèi)體酸化成熟障礙對內(nèi)體循環(huán)相關調(diào)控分子的作用
　　 CQ預處理抑制內(nèi)體酸化成熟后再加入LPS刺激，Rab7b的mRNA表達較未加CQ處理前顯著下降，而Rab10和Rab11a的mRNA表達較未加CQ處理前顯著上調(diào)。
　　 (2

14、)內(nèi)體酸化成熟障礙對炎癥負調(diào)控分子的作用
　　 LPS刺激RAW264.7細胞后，負調(diào)控分子A20，Tollip，MyD88s的mRNA表達顯著上調(diào)，而CQ預處理1h后再加入LPS(100ng/ml)刺激，A20，Tollip，MyD88s的mRNA表達較LPS組均有顯著上調(diào)(P<0.05)。
　　 結論
　　 (1)內(nèi)體酸化成熟障礙對LPS-TLR4介導的MyD88依賴和TRIF-TRAM依賴的兩條信號轉(zhuǎn)導途徑

15、均有抑制作用。
　　 (2)內(nèi)體酸化成熟障礙可導致LPS-TLR4介導的炎癥負調(diào)控分子的表達上調(diào)，這可能與MyD88依賴和TRIF-TRAM依賴的兩條信號轉(zhuǎn)導途徑被抑制調(diào)密切相關。
　　 (3)內(nèi)體酸化成熟障礙可導致內(nèi)化后的LPS-TLR4復合物在胞內(nèi)累積，出現(xiàn)散在分布、共定位明顯減少甚至消失的現(xiàn)象，其機制可能為：內(nèi)體的酸化成熟并非內(nèi)體中受體和配體解離的單一因素，可能存在其它多種因素的綜合作用。內(nèi)體酸化成熟障礙可能會影響