雞巨噬細胞在LPS和小鼠紅細胞刺激下體外分化成熟的特征.pdf

1、巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，它在殺滅病原體，遞呈抗原和調(diào)節(jié)免疫應答的過程中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，關于雞巨噬細胞的體外分離培養(yǎng)鮮有報道。本次研究使用細胞系L929和HD-11細胞系的細胞上清液刺激骨髓來源和外周血來源的巨噬細胞，首先通過多組交叉實驗，以前體細胞的濃度、刺激因子的終濃度、以及培養(yǎng)的時間作為變量，優(yōu)化篩選出最優(yōu)的巨噬細胞體外培養(yǎng)的條件。在最優(yōu)條件下培養(yǎng)巨噬細胞，待其到達最優(yōu)培養(yǎng)天數(shù)后，通過核染實驗以及小鼠紅細胞（mRC）

2、吞噬實驗觀察它們的形態(tài)學特征和吞噬功能，通過普通PCR檢測了表面標志CD11b的特異性基因，并將所得序列進行比對。最后，將活化的巨噬細胞分別與LPS和小鼠的紅細胞繼續(xù)培養(yǎng)，使用熒光定量PCR的方法檢測特征性細胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、iNOS、TGF-β、TNF-α）基因的轉(zhuǎn)錄水平以及免疫分子（MHCI-α、MHCII-β、Ii）基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果顯示巨噬細胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：前體細胞

3、的初始濃度為6×105個/mL、刺激因子HD-11-CM和L929-CM的終濃度為30％，以及巨噬細胞的最優(yōu)培養(yǎng)天數(shù)為5~8天。在最優(yōu)條件下得到的活化的巨噬細胞呈現(xiàn)出梭形、細胞核增大、具有吞噬功能的特征。此外，這些細胞高水平轉(zhuǎn)錄特征性基因cd11b。結(jié)果顯示，與對照組相比，在受到兩種不同的刺激劑刺激而產(chǎn)生極化的巨噬細胞的Mhc和Ii基因的轉(zhuǎn)錄量顯著降低（P<0.01）。在LPS的刺激下體外培養(yǎng)所得的四組細胞均向M1方向進行極化，表現(xiàn)為巨

4、噬細胞轉(zhuǎn)錄M1特征細胞因子IL-12、IL-6、IL-2和 iNOS的水平升高顯著（P<0.01），TNF-ɑ升高（P<0.01），但IL-1β表達量下降（P<0.05）；同時M2型特征細胞因子IL-10轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（P<0.01），而TGF-β轉(zhuǎn)錄水平明顯升高（P<0.01）。小鼠紅細胞刺激極化的成熟骨髓源巨噬細胞轉(zhuǎn)錄M1型特征性細胞因子IL-12顯著升高（P<0.01），IL-6、IL-2的升高（P<0.05），而IL-1β、i

5、NOS、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平則顯著下降（P<0.01），M2型特征性細胞因子L-10和TGF-β轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降（P<0.01）。這些結(jié)果不僅提供了雞巨噬細胞體外培養(yǎng)的生物學特征，而且表明了刺激劑影響巨噬細胞體外極化的作用。
　　綜上所述，本次研究建立了血液源和雞骨髓源巨噬細胞體外分離培養(yǎng)極化的方法。通過在形態(tài)學、功能學以及分子水平的檢測證明培養(yǎng)所得的四種細胞（L929-CM刺激的骨髓源巨噬細胞、L929-CM刺激的血液源巨噬細胞