白藜蘆醇增敏卡非佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.探究白藜蘆醇（resveratrol,RSV）對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）細(xì)胞增殖活力的影響。
　　2.探究RSV能否增敏卡非佐米（carfilzomib, CFZ）對(duì)MM細(xì)胞的殺傷作用及增敏的可能機(jī)制，為CFZ聯(lián)合RSV應(yīng)用于MM的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.探究RSV聯(lián)合CFZ作用MM細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)自噬水平的變化，并且通過(guò)抑制自噬途徑觀察MM細(xì)胞凋亡水平的變化，為進(jìn)

2、一步提高增敏作用提供新的思路。
　　方法：
　　1. MTT法檢測(cè)RSV對(duì)MM細(xì)胞增殖活力的影響：以4種MM細(xì)胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R為研究對(duì)象，用不同濃度梯度的 RSV孵育 MM細(xì)胞24 h后，采用 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的變化。然后用最小抑制濃（minimum inhibitory concentration,MIC）分別處理各細(xì)胞株24 h、48 h、72 h后觀察細(xì)胞增殖活力的變化。

3、>　　2. MTT法檢測(cè)RSV預(yù)處理前后CFZ對(duì)MM細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的變化：根據(jù)方法1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)RSV最敏感的MM細(xì)胞株LP-1為研究對(duì)象。將實(shí)驗(yàn)分為兩組：組1用50μmol/L RSV預(yù)處理LP-1細(xì)胞24h后，移除RSV換新的培養(yǎng)基后，再給予不同濃度CFZ處理24 h；組2直接用不同濃度梯度的CFZ孵育LP-1細(xì)胞24 h，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFZ對(duì)MM細(xì)胞的增殖抑制作用，并分別得出組1與組2的CZF的IC50。
　　3.

4、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化：將實(shí)驗(yàn)分設(shè)為四組：對(duì)照組、RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組。對(duì)照組：不給予處理；RSV組：50μmol/L RSV孵育LP-1細(xì)胞24 h；CFZ組：40 nmol/L CFZ孵育細(xì)胞24 h；RSV+CFZ組：50μmol/L RSV預(yù)處理LP-1細(xì)胞24 h后，移除RSV后并再給予CFZ40nmol/L孵育24 h。收集細(xì)胞PI染色上流式機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋

5、亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MM細(xì)胞凋亡率的變化：同方法3將實(shí)驗(yàn)分設(shè)為4組，給予不同的處理后收集細(xì)胞FITC/PI染色上流式機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)活性氧（reactive oxygen species, ROS）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ROS變化：同方法3將實(shí)驗(yàn)分設(shè)為4組，給予LP-1細(xì)胞不同的處理后收集細(xì)胞加入熒光探針DCFH-DA，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　6.加入活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（ N-Acetyl

6、cysteine，NAC）及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）后MM細(xì)胞內(nèi)ROS的變化及凋亡的變化：實(shí)驗(yàn)分設(shè)為8組，分別為對(duì)照組、RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組、NAC組、NAC+RSV+CFZ組、3-MA組、3MA+RSV+CFZ組，3mmol/L NAC預(yù)處理LP-1細(xì)胞2 h后，1 mmol/L3-MA預(yù)處理LP-1細(xì)胞1 h后，再給予方法4、5處理，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組ROS水平及凋亡

7、率的變化。
　　7.Western bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩藥聯(lián)合作用凋亡相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3 I/II的表達(dá)水平以及加入3-MA后自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；同方法3將實(shí)驗(yàn)分為4組，給予不同的處理后收集細(xì)胞，采用Western bloting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p38 MAPK、抗凋亡蛋白survivin，Sirt1以及促凋亡蛋白smac、caspase3的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3I/II的表達(dá)變化。加入自

8、噬抑制劑3-MA后再給予RSV+CFZ后LC3 I/II及caspase3的表達(dá)變化。
　　8. Smac的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：將實(shí)驗(yàn)分設(shè)為4組：對(duì)照組、RSV+CFZ組、siRNA、siRNA+RSV+CFZ組,采用Western bloting檢測(cè)抗凋亡蛋白survivn，sirt-1以及促凋亡蛋白Smac、的表達(dá)水平。
　　9.所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件、G

9、raphPad Prism5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism5作圖，Photoshop對(duì)Western blotting進(jìn)行整理、分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1． MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：RSV對(duì)4種 MM細(xì)胞株 LP-1、U266、 MM.1S、MM.1R均具有生長(zhǎng)抑制作用，并且隨著濃度增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)(n=3, P<0.05)。以各自MIC分別處理細(xì)胞24、48、72 h，隨

10、著時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)（n=3, P<0.05）。
　　CFZ對(duì)LP-1細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，并且隨著藥物濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，IC50-1為8.45±0.76 nmol/L；以RSV預(yù)處理后的LP-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，給予不同濃度CFZ處理，IC50-2為為6.92±1.78 nmol/L。
　　2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果得出：與對(duì)照組相比，RSV組在G0/G1期、S期細(xì)胞比例增高，CFZ組、RSV+CFZ組在

11、S期、G2/M期細(xì)胞比例增高。與CFZ組相比，RSV+CFZ組在G2/M期細(xì)胞比例增高（P<0.01）。
　　3．流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)得出：對(duì)照組、RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組凋亡率（％）分別為9.07±2.60、11.63±4.70、42.50±2.31、74.93±5.01；CFZ組、RSV+CFZ組的凋亡率高于對(duì)照組、RSV組，且CFZ+RSV組的凋亡率高于CFZ組，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

12、　　4.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)ROS實(shí)驗(yàn)得出: RSV組、CFZ組、RSV+CFZ組、3-MA組、3-MA+ RSV+CFZ組、NAC組、NAC+RSV+CFZ組ROS水平為對(duì)照組的0.98±0.72、1.02±0.72、1.32±0.23、1.18±0.05、1.32±0.16、0.83±0.14、1.14±0.19倍；與對(duì)照組相比，RSV+CFZ組、3-MA+ RSV+CFZ組ROS水平均升高（P＜0.05）；與CFZ組相比，RSV+CFZ組

13、ROS水平升高(P＜0.05)；與RSV+CFZ組相比，NAC+RSV+CFZ組ROS水平降低，3-MA+ RSV+CFZ組ROS水平升高，但均未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值分別為0.128，0.998。
　　5.自噬抑制劑預(yù)處理前后RSV+CFZ組凋亡率的變化：對(duì)照組、RSV+CFZ組、3-MA組、3-MA+RSV+CFZ組凋亡率（%）分別為10.37±3.41、77.10±2.98、9.63±0.32、90.13±8.24；3-MA+R

14、SV+CFZ組的凋亡率高于CFZ+RSV，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　6 NAC預(yù)處理前后RSV+CFZ組凋亡率的變化：對(duì)照組、RSV+CFZ組、NAC組、NAC+RSV+CFZ組凋亡率（%）分別為8.03±1.36、69.67±1.59、8.87±0.90、63.70±1.64；RSV+CFZ組、NAC+RSV+CFZ組凋亡率均高于對(duì)照組及NAC組（P＜0.001）；NAC+RSV+CFZ組的凋亡率低于CFZ+RS

15、V組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　7.WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)RSV+CFZ組p38、smac、caspase3表達(dá)升高，survivin、sirt-1表達(dá)減少，以及自噬相關(guān)蛋白LC3 I/II表達(dá)增高。加入自噬抑制劑后，3-MA+RSV+CFZ組LC3 I/II表達(dá)下降，caspase3剪切體減少。與RSV+CFZ組相比，siRNA+ RSV+CFZ組smac、Sirt-1表達(dá)水平下降，survivin表達(dá)未有明顯變化。

16、>　　結(jié)論：RSV可增敏CFZ對(duì)MM細(xì)胞的殺傷作用，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制及促凋亡作用增強(qiáng)。首先，生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)可能是ROS/p38MAPK信號(hào)通路激活從而使G2/M周期阻滯增強(qiáng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。其次，促凋亡作用可能是通過(guò)ROS/sirt-1及smac/survivin兩條相互代償?shù)男盘?hào)通路發(fā)揮作用。此外，兩藥聯(lián)合作用產(chǎn)生保護(hù)性的自噬現(xiàn)象，阻斷自噬可進(jìn)一步增強(qiáng)RSV聯(lián)合CFZ的促凋亡作用，因此，RSV、CFZ以及自噬抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用為 MM的臨床治