PEMF通過PPARγ-Axin2-Wnt信號軸調節(jié)GIOP大鼠骨髓脂質代謝及其影響骨代謝的機制研究.pdf

1、長期使用糖皮質激素（GCs）可導致嚴重的副作用，例如骨量減少、骨密度降低而最終引起的糖皮質激素性骨質疏松癥（GIOP）。GIOP是最常見的一類繼發(fā)性骨質疏松癥。大約30％-50%接受GCs治療至少1年的患者患有GIOP，并且其發(fā)生骨質疏松性骨折的風險高，即使輕微的損傷后也會發(fā)生脊柱、髖骨和肋骨的骨折。GIOP是嚴重影響長期使用GCs患者生活質量的不良因素。因此，GIOP的防治具有重要的臨床意義。
　　針對GIOP病因進行干預治療才

2、能取得最好的療效。GIOP的發(fā)病機制與年齡、雌激素缺乏、制動等因素引起的骨質疏松癥（OP）不同。GCs直接作用骨髓間充質基質細胞（BMSCs），誘導其分化成脂肪細胞并導致骨髓腔內脂肪細胞堆積，引起骨髓脂質代謝紊亂，嚴重影響成骨細胞分化，骨形成減少，最終導致骨質疏松。因此，GCs引起的骨髓脂質代謝紊亂在GIOP發(fā)病機制中起著重要作用。長期使用GCs也可以促使骨髓外脂肪組織動員和分解，增高機體血清總膽固醇（TCHO）和甘油三酯（TG）水平，

3、導致高脂血癥，而高血脂癥可先于骨質疏松出現(xiàn)。脂質代謝和骨質疏松有著密切關系。臨床上應用降血脂藥物治療的同時可增加患者骨密度水平，降低骨折的風險。如果能有效的抑制骨髓脂質代謝紊亂和糾正機體血脂異常狀態(tài)，可以對GIOP的發(fā)病、骨質疏松程度、骨折風險起到防治作用。
　　GIOP臨床藥物治療花費高、副作用多，因此有必要探尋一種安全、副作用小、費用低廉的治療方法。脈沖電磁場（PEMF）作為一種無創(chuàng)的物理因子治療手段，已經廣泛應用于多種骨科疾

4、病。循證醫(yī)學已證實PEMF在治療骨質疏松方面安全且有效，可以作為防治OP的輔助手段。臨床與實驗研究發(fā)現(xiàn)PEMF在抗骨質疏松的同時還可以改善機體的血脂異常。目前尚未有研究PEMF通過調節(jié)GIOP脂質代謝途徑干預骨代謝的相關報道。介于脂質代謝對GIOP發(fā)病的影響，探討PEMF對GIOP的療效是否得益于對其脂質代謝的調控，對PEMF防治GIOP的機制研究有著重要意義。
　　目前采用GCs誘導GIOP動物模型的方法很多，但GCs選擇、給藥

5、途徑、用藥劑量等要素不統(tǒng)一，會對后續(xù)研究工作造成一定影響。本研究在參考相關文獻的基礎上，擬采用肌注地塞米松的方法建立GIOP大鼠模型，為規(guī)范建立GIOP動物模型提供相關實驗依據，同時探討PEMF調控 GIOP大鼠脂質代謝信號通路的機制及其對骨代謝的影響，對于初步闡明PEMF抗骨質疏松的機制具有重要的科學意義和相關臨床應用價值。
　　第一部分 GIOP大鼠模型的建立
　　目的：
　　采用肌注超生理劑量的地塞米松構建GIO

6、P大鼠模型，試圖建立可靠穩(wěn)定的造模方法，為探討PEMF治療GIOP的潛在機制提供實驗對象。
　　方法：
　　20只健康雌性SD大鼠隨機分為對照組和GIOP模型組。GIOP模型組大鼠右側臀部肌注地塞米松（2.5 mg/kg，每周2次）連續(xù)12周。對照組大鼠右側臀部肌注生理鹽水（0.5 ml/kg，每周2次）連續(xù)12周。12周后進行骨密度、骨組織形態(tài)計量學分析、骨代謝生化指標和脂質代謝生化指標檢測評價GIOP大鼠模型。
　

7、　結果：
　　與對照組大鼠相比，模型組大鼠全身骨密度和骨礦鹽含量明顯下降，骨小梁破壞嚴重、數(shù)量減少，血清ALP水平降低，血清TRAP、TG, TCHO和LDL水平均顯著升高。
　　結論：
　　肌肉注射地塞米松（2.5mg/kg,2次/周）12周可以成功建立GIOP大鼠模型，為本研究提供穩(wěn)定、可靠的動物模型。
　　第二部分PEMF對GIOP大鼠骨髓脂質代謝的影響及機制
　　目的：
　　研究PEMF干預對

8、GIOP大鼠BMSCs成脂分化和脂質代謝的影響，探討相關信號通路的調控，初步闡明PEMF干預GIOP大鼠脂質代謝的作用機制。
　　方法：
　　(1)40只健康SD雌性大鼠隨機分為正常組、GIOP模型組、鈣劑治療組和PEMF治療組。GIOP模型組、鈣劑治療組和PEMF治療組采用肌肉注射地塞米松（2.5mg/kg,2次/周）12周復制GIOP大鼠模型。12周后進行骨密度、骨代謝生化指標和脂質代謝生化指標檢測評價GIOP大鼠模型。

9、
　　(2)PEMF治療組大鼠給予PEMF（50 Hz，4.0 mT）干預12周。鈣劑治療組大鼠給予葡萄糖酸鈣片灌胃治療及PEMF假輻射12周。正常組和GIOP模型組大鼠均給予PEMF假輻射和生理鹽水灌胃處理12周。
　　(3)采用血清脂質代謝生化指標檢測評價各組大鼠血脂狀況；
　　(4)采用油紅O染色和L4椎體骨組織病理學觀察評價各組大鼠骨髓腔內脂肪細胞分化程度；
　　(5)Real-time PCR檢測脂質代

10、謝相關指標PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2基因表達水平；
　?。?）Western bolt檢測檢測脂質代謝相關指標PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2蛋白表達水平。
　　結果：
　?。?）與正常組大鼠相比，GIOP模型組、鈣劑治療組和PEMF治療組大鼠給予肌注地塞米松12周后全身骨密度和骨礦鹽含量明顯下降，血清ALP水平降低，血清TRAP、TG, TCHO和LDL水平均顯著升高。GIO

11、P大鼠模型復制成功。
　?。?）血清脂質代謝生化指標檢測結果表明PEMF干預12周后可以顯著改善GIOP大鼠血脂異常；
　?。?）油紅O染色和L4椎體骨組織病理學觀察表明PEMF干預12周后GIOP大鼠骨髓內脂肪細胞減少；
　?。?）Real-time PCR檢測結果表明：PEMF干預12周后GIOP大鼠PPAR-γ、 C/EBPα、FABP4和Axin2基因表達水平顯著下調；
　?。?）Western bolt

12、檢測結果表明：PEMF干預12周后GIOP大鼠PPAR-γ、 C/EBPα、FABP4和Axin2蛋白表達水平顯著下調。
　　結論：
　　PEMF干預能夠抑制GIOP大鼠BMSCs成脂分化，減少骨髓內脂肪細胞，改善骨髓脂質代謝紊亂。PEMF干預可能通過下調Axin2/PPARγ信號通路來抑制GIOP大鼠BMSCs脂肪分化。
　　第三部分 PEMF對GIOP大鼠骨代謝的影響及機制
　　目的：
　　本部分研究以

13、第二部分研究的GIOP大鼠作為實驗對象，觀察PEMF干預對GIOP大鼠BMSCs成骨分化和骨代謝的影響，進一步探討相關信號通路的調控，初步闡明PEMF干預GIOP大鼠骨代謝的作用機制。
　　方法：
　?。?）采用骨密度及骨礦鹽含量檢測評價各組大鼠骨量狀況；
　?。?）采用血清骨代謝生化指標檢測評價各組大鼠骨代謝狀況；
　?。?）采用骨組織病理學和骨組織形態(tài)計量學分析評價腰椎體內骨小梁狀況；
　?。?）采用R

14、eal-time PCR檢測Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG、RANKL、Runx2、Dkk1和SOST基因表達水平；
　?。?）采用Western bolt檢測Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG、RANKL、Runx2、Dkk1和SOST蛋白表達水平。
　　結果：
　?。?）骨密度檢測結果表明PEMF干預12周可以顯著改善GIOP大鼠骨質疏松程度；
　?。?）血清骨代謝生化指標

15、檢測結果表明PEMF干預12周后可以顯著改善GIOP大鼠骨代謝異常；
　?。?）骨組織病理學和骨組織形態(tài)計量學分析結果表明PEMF干預12周后可以改善GIOP大鼠腰椎體內骨小梁狀況；
　?。?）Real-time PCR檢測結果表明PEMF干預12周后可以顯著上調GIOP大鼠Wnt10b、 LRP5、β-catenin和OPG基因表達水平，顯著下調RANKL和Dkk1基因表達水平；
　?。?）Western bolt檢

16、測結果表明PEMF干預12周后可以顯著上調GIOP大鼠Wnt10b、LRP5和Runx2蛋白表達水平，顯著下調RANKL和Dkk1蛋白表達水平。
　　結論：
　　PEMF干預能夠促進GIOP大鼠BMSCs成骨分化，改善骨代謝異常，抑制骨量流失，促進骨形成。本部分研究表明PEMF干預激活Wnt10b/LRP5/β-catenin信號通路可能是由于Axin2/PPARγ信號通路被抑制以及Dkk1表達下調來實現(xiàn)。PPARγ-Axi