E3泛素化酶siah-1核聚集在同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：明確高同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，探討核內(nèi)siah-1聚集在此凋亡過(guò)程中所起機(jī)制的研究。
　　方法：（1）用不同濃度同型半胱氨酸（Hcy）培養(yǎng)C6細(xì)胞，模擬高同型半胱氨酸損傷細(xì)胞模型，觀察Hcy處理后細(xì)胞活力變化，CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞增值率，選定干預(yù)濃度；（2）TUNEL法檢測(cè)正常組與同型半胱氨酸處理組細(xì)胞凋亡程度；（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)測(cè)定同型半胱氨酸對(duì)C6細(xì)胞內(nèi)siah-1

2、基因、GAPDH基因的mRNA表達(dá)；蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測(cè)siah-1、GAPDH蛋白表達(dá)水平的影響；（4）使用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察同型半胱氨酸處理細(xì)胞后胞內(nèi) siah-1及GAPDH的分布和亞細(xì)胞定位改變；（5）用siah-1-siRNA干擾細(xì)胞后，real-time PCR及Western blot檢測(cè)干擾效率；（6）觀察siah-1干擾后正常組與同型半胱氨酸處理組細(xì)胞核內(nèi)GAPDH蛋白表達(dá)影響

3、，免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡明確siah-1干擾對(duì)GAPDH核轉(zhuǎn)位改變。（7）觀察siah-1干擾后正常組與同型半胱氨酸處理組細(xì)胞內(nèi)P53及caspase3表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：（1）CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸處理C6細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，且隨著同型半胱氨酸濃度增加，細(xì)胞增殖能力逐漸下降；（2）TUNEL染色發(fā)現(xiàn)：正常組細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性染色極少，而同型半胱氨酸處理組細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性明

4、顯增加，提示一定濃度的同型半胱氨酸可促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡。（3）Real-time PCR結(jié)果顯示：同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，Hcy處理組細(xì)胞內(nèi)siah-1、GAPDH mRNA表達(dá)明顯增加，且隨著同型半胱氨酸濃度增加而增加，呈濃度依賴性；（4）Western blot結(jié)果提示：同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)siah-1、GAPDH蛋白表達(dá)也明顯增加，同樣隨著同型半胱氨酸濃度增加而增加，呈濃度依賴性；（5）免疫熒光

5、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組細(xì)胞siah-1及GAPDH主要在細(xì)胞漿表達(dá)，細(xì)胞核少有或者無(wú)表達(dá)，而同型半胱氨酸處理組細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)siah-1及GAPDH聚集現(xiàn)象；（6）用siRNA干擾后，可有效抑制細(xì)胞內(nèi)siah-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)；激光共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果顯示，干擾siah-1的表達(dá)可減少同型半胱氨酸所致的GAPDH的聚集及核轉(zhuǎn)位。提示了siah-1參與了同型半胱氨酸誘導(dǎo)的 GAPDH核轉(zhuǎn)位，形成siah-1/GAPDH復(fù)合物后，由胞漿

6、向胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位，發(fā)揮促凋亡作用。
　　結(jié)論：同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞后可誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)siah-1、GAPDH表達(dá)增加，發(fā)生由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位；干擾siah-1后，可以減少同型半胱氨酸所致核內(nèi)siah-1及GADPH聚集現(xiàn)象。提示了siah-1參與了GAPDH由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位的運(yùn)動(dòng)機(jī)制，同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞后促進(jìn)siah-1/GAPDH復(fù)合物的形成，并從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，形成核內(nèi)聚集，最后發(fā)生細(xì)胞凋亡，而對(duì)siah-1