同型半胱氨酸與銅聯(lián)合作用誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　大量研究表明高同型半胱氨酸血癥（HHcy）和高銅血癥是心血管疾病的兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的危險(xiǎn)因子，當(dāng)兩者同時(shí)存在時(shí)可大大增強(qiáng)對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷作用，同型半胱氨酸與銅的比例不同時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷也不相同，本研究探討Hcy和Cu的聯(lián)合作用對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的損傷及不同比例的Hcy、Cu同時(shí)存在時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用，探討細(xì)胞死亡的方式及加入抗氧化劑后能否起到保護(hù)作用。
　　方法：
　　1、提取原代心肌細(xì)胞后分成若干實(shí)驗(yàn)組

2、，MTT實(shí)驗(yàn)組分為Hcy50、100、200μM，Cu50、100、200μM，Hcy/Cu比例為4/1、2/1，1/1組處理72h，DCF-DA、Mitosox-Red及羅丹明123染色劑組分為Hcy100μM+Cu50μM處理2、4、8、16、24h，Hcy50、100、200μM，Cu50、100、200μM，及Hcy100μM、Hcy100μM+Cu25μM、Hcy100μM+Cu50μM、Hcy100μM+Cu100μM組處理

3、24h，NOX實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Hcy100μM+Cu50μM組處理24h，氧消耗率實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及Hcy100μM+Cu50μM組處理8h，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分為Hcy100μM+Cu50μM2、4、8、12、24h組，westernblot實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，H200μM+Cu100μM8h、12h、24h、48h,H200μM+Cu50μM12h、24h、48h、72h，H100μM+Cu50μM24h、48h、72h，對(duì)照組，H100

4、μM+Cu50μM24h，H100μM+Cu50μM+NH4CL2024h，H100μM+Cu50μM+3MA24h等組。
　　2、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活率；DCF-DA染色劑檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量；Mitosox-Red染色劑檢測(cè)線粒體內(nèi)ROS的含量；羅丹明123檢測(cè)細(xì)胞膜電位的變化；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)NADPH氧化酶（NOX）的活性；細(xì)胞能量代謝實(shí)時(shí)測(cè)定儀檢測(cè)氧消耗率。TUNAL、DAPI染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的死亡方式；qRT-

5、PCR法檢測(cè)p53、SCO2mRNA水平，westernblot檢測(cè)心肌細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、在倒置顯微鏡觀察下，體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞形態(tài)隨著時(shí)間的增加發(fā)生變化，培養(yǎng)24小時(shí)后部分心肌細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)，72小時(shí)后大部分細(xì)胞同步搏動(dòng)，且頻率在60-100次/分，經(jīng)Hcy和Cu處理后細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。細(xì)胞開(kāi)始變圓，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。
　　2、處理72h后，MTT結(jié)果提示Hcy和Cu單獨(dú)處理對(duì)心肌細(xì)胞

6、的損傷作用并不明顯，當(dāng)Hcy與Cu聯(lián)合處理后極大的引起心肌細(xì)胞死亡，且隨著Cu/Hcy比例的上升，損傷作用更明顯。
　　3、DCF-DA染色實(shí)驗(yàn)：無(wú)論是Hcy、Cu單獨(dú)處理還是Hcy與Cu聯(lián)合處理細(xì)胞內(nèi)的ROS無(wú)明顯變化。
　　4、Mitosox-Red染色實(shí)驗(yàn)：Hcy、Cu單獨(dú)處理后線粒體的ROS變化并不明顯，但兩者共同作用后線粒體內(nèi)ROS增加，且在一定時(shí)間內(nèi)隨著Cu/Hcy的比值的升高ROS產(chǎn)生增多。
　　5、HE

7、T染色實(shí)驗(yàn)：Hcy與Cu共同作用后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)超氧陰離子增加。
　　6、羅丹明123染色實(shí)驗(yàn)：隨著Hcy溶度的升高，細(xì)胞的存活率下降，Hcy與Cu共同作用后細(xì)胞的存活率顯著下降，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)及Cu/Hcy的比例的上升細(xì)胞存活率下降。
　　7、NADPH氧化酶（NOX）活性：經(jīng)Hcy和Cu聯(lián)合處理后，NOX活性并不增加。
　　8、心肌細(xì)胞氧消耗率：經(jīng)過(guò)Hcy和Cu聯(lián)合處理后，線粒體復(fù)合物活性下降。
　　9、TU

8、NEL、DAPI染色實(shí)驗(yàn)：TUNEL染色為陰性，兩組DAPI染色圖無(wú)明顯區(qū)別，兩者的合并圖也無(wú)明顯區(qū)別。
　　10、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)Hcy和Cu聯(lián)合處理后，細(xì)胞p53、SCO2mRNA的量迅速減少。
　　11、各組心肌細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)：Hcy+Cu處理后隨著時(shí)間的增加LC3Ⅱ的表達(dá)量逐漸增加。Hcy+Cu的溶度升高后LC3Ⅱ的表達(dá)量亦增加，加入3-MA后LC3Ⅱ表達(dá)量下降，而加入氯化銨后LC3Ⅱ表達(dá)量繼續(xù)增加。<