通過生物材料結(jié)構(gòu)-成分改性促進(jìn)干細(xì)胞存活及血管化骨再生的研究.pdf

1、研究目的：
　　腫瘤、炎癥、外傷等多種原因均可造成頜骨組織缺損。干細(xì)胞在介導(dǎo)骨再生過程中起到了重要作用。然而，針對大塊頜骨再生，一方面由于血管化問題，往往導(dǎo)致負(fù)載干細(xì)胞過早凋亡壞死；另一方面由于支架材料缺乏足夠的成骨誘導(dǎo)能力，導(dǎo)致干細(xì)胞參與成骨受限，大大降低了骨再生效果。為此，本研究嘗試通過生物材料管道設(shè)計、氧化石墨烯銅納米顆粒（GO-Cu）涂層等手段來調(diào)控干細(xì)胞體內(nèi)存活以及血管化骨再生，為促進(jìn)大塊頜骨再生的生物材料設(shè)計提供新的思

2、路。
　　材料與方法：
　　1.分離培養(yǎng)犬骨髓干細(xì)胞（BMSCs）和脂肪干細(xì)胞（ADSCs）；體外使用RT-PCT、免疫熒光等方法系統(tǒng)比較二者的成骨分化能力；GFP標(biāo)記示蹤觀察裸鼠皮下異位成骨能力；進(jìn)一步在犬上頜竇提升模型上，采用序貫熒光標(biāo)記和硬組織切片等手段評估二者的快速骨再生效果。
　　2.使用多孔/管道絲蛋白支架體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），檢測HUVECs的生長、分泌活性及血管樣結(jié)構(gòu)預(yù)構(gòu)情況；移植于

3、裸鼠皮下后，采用Microfil血管灌注、激光多普勒血流檢測、組織學(xué)分析等方法評估大塊支架材料整體快速血管化效果。使用上述體外內(nèi)皮化預(yù)構(gòu)的多孔/管道絲蛋白支架負(fù)載小鼠BMSCs，移植于體內(nèi)，使用活體熒光成像技術(shù)檢測BMSCs體內(nèi)存活情況。
　　3.制備氧化石墨烯銅納米顆粒（GO-Cu），涂層于硫酸鈣骨水泥（CPC）多孔支架材料表面，ICP-AES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測銅離子緩釋情況。Live/Dead細(xì)胞染色、MTT檢測等

4、方法評估GO-Cu對大鼠BMSCs的細(xì)胞毒性；免疫熒光染色、Western Blot(WB)、RT-PCR等方法檢測GO-Cu調(diào)控大鼠BMSCs成骨向分化以及參與成血管誘導(dǎo)活性的作用機(jī)制；最后在大鼠顱骨缺損模型上評估GO-Cu涂層CPC支架材料（CPC/GO-Cu）的血管化骨再生效果。
　　研究結(jié)果：
　　1. BMSCs和ADSCs表面干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平相似，但BMSCs的體外成骨向分化能力明顯優(yōu)于ADSCs、分化速度更

5、快，而ADSCs更易向成脂方向分化；經(jīng)體外誘導(dǎo)后隨支架材料埋植于裸鼠皮下四周時，BMSCs可以形成新骨，而ADSCs僅向成骨細(xì)胞分化、并未有骨組織形成；在犬上頜竇提升模型上，BMSCs較ADSCs同樣表現(xiàn)出了更強(qiáng)、更快的骨再生能力。
　　2.多孔/管道絲蛋白支架促進(jìn)了HUVECs體外生長、成血管相關(guān)因子分泌以及血管樣結(jié)構(gòu)形成；將大塊支架材料埋植于裸鼠皮下，管道結(jié)構(gòu)促進(jìn)了宿主組織細(xì)胞長入、加速了血管化進(jìn)程；多孔/管道絲蛋白支架預(yù)植H

6、UVECs后進(jìn)一步促進(jìn)了血管化進(jìn)程；使用多孔/管道絲蛋白支架預(yù)植HUVECs構(gòu)建的內(nèi)皮化復(fù)合物來負(fù)載BMSCs，能夠更好地維持移植干細(xì)胞的體內(nèi)存活。
　　3. GO-Cu在合適濃度范圍內(nèi)對BMSCs無明顯細(xì)胞毒性，并且通過激活Erk1/2信號通路而促進(jìn)BMSCs高表達(dá)Hif-1α，并刺激分泌BMP-2和VEGF成骨成血管蛋白因子；GO-Cu涂層于CPC支架材料后，可以長期緩慢釋放銅離子，即能維持局部的銅離子濃度，又避免了爆發(fā)性、快

7、速釋放所造成的銅離子蓄積；將CPC/GO-Cu置于大鼠顱骨缺損區(qū)，明顯促進(jìn)了血管化骨再生。
　　研究結(jié)論：
　　本論文系統(tǒng)比較了ADSCs和BMSCs的成骨效果，優(yōu)選了BMSCs作為頜面部骨組織快速再生的種子細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)使用多孔/管道結(jié)構(gòu)支架預(yù)植內(nèi)皮細(xì)胞，可以促進(jìn)大塊支架材料整體快速血管化，進(jìn)而促進(jìn)負(fù)載的BMSCs細(xì)胞體內(nèi)存活。還制備了氧化石墨烯銅納米顆粒，GO-Cu涂層可以刺激BMSCs分泌成骨成血管生長因子，促進(jìn)血管化骨再