

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、本文對結核抗原持續(xù)刺激致T細胞耗竭實驗研究及亞單位疫苗LT70-DPC的研發(fā)進行了闡述。本研究分為三個部分:
第一章:結核抗原持續(xù)刺激致T細胞耗竭實驗研究。結核病是一種慢性感染性疾病,由結核分枝桿菌感染引起,是全球危害最為嚴重的傳染病之一。有研究報道嚴重的結核病患者CD4+T細胞,尤其是Th1細胞數目下降。我們也發(fā)現痰菌陽性的纖維空洞型結核病患者對結核分枝桿菌抗原的T細胞免疫應答能力低于密切接觸者和結核病新發(fā)病人。以上現象都提
2、示嚴重的結核分枝桿菌感染可能造成機體免疫功能低下,其發(fā)生機制值得深入研究。
目的:通過結核抗原持續(xù)刺激建立T細胞耗竭小鼠模型,分析抗原持續(xù)刺激在結核病T細胞耗竭中的作用及可能的機制和治療措施。
方法:⑴采用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin。BCG)免疫C57BL/6小鼠,用結核亞單位蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(簡稱 LT70)聯合 M
3、tb10.4-HspX(簡稱 MH)反復免疫10次,模擬結核分枝桿菌抗原持續(xù)刺激的狀態(tài),建立T細胞耗竭模型。⑵通過酶聯免疫斑點試驗和酶聯免疫吸附試驗分析脾臟T細胞IFN-γ和IL-2的分泌水平;通過流式細胞術檢測 CD4+、CD8+ T細胞數目;通過 TB10.44-12五聚體標記檢測TB10.4特異性的記憶性CD8+ T細胞數目;通過流式細胞術檢測CD4+/CD8+ T細胞表面程序性死亡受體1(Programmed Death1。PD
4、-1)的表達;通過 BCG和銅綠假單胞菌攻擊,檢測不同模型組保護效果差異;進一步檢測 CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數量和增殖能力。⑶在T細胞耗竭模型基礎上,應用造血干細胞、間充質干細胞、IL-2和雷帕霉素進行干預治療,檢測以下指標:抗原特異性細胞因子 IFN-γ和 IL-2的分泌水平;TB10.4特異性的記憶性CD8+T細胞的數量;CD4+T細胞表面抑制性受體PD-1的表達;BCG攻擊后的保護效果;CD34-L
5、in-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數量和增殖能力。通過上述指標檢測評價不同治療方案的治療效果。⑷在IL-2具有逆轉 T細胞耗竭作用的基礎上,進一步探索 IL-2與造血干細胞增殖分化相關信號通路 JAK-STAT和PI3K之間的關系,揭示IL-2逆轉T細胞耗竭的分子機制。
結果:①通過BCG免疫一次,結核亞單位疫苗 LT70和 MH加強免疫10次,成功建立T細胞耗竭模型。②相比于結核抗原短暫刺激(加強免疫2次)組。T細胞
6、耗竭組:細胞因子 IFN-γ和 IL-2的分泌水平顯著性降低(p<0.01);CD4+、CD8+ T細胞數目顯著性減少(p<0.05);TB10.44-12特異性的記憶性CD8+ T細胞數量顯著減少(p<0.05);CD4+ T細胞表面抑制性受體 PD-1表達水平升高(p<0.05);BCG和銅綠假單胞菌攻擊后清除率下降(p<0.05),機體抗感染保護能力明顯下降;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數量降低,其增殖能
7、力被抑制(p<0.05)。③應用造血干細胞、間充質干細胞、IL-2和雷帕霉素進行干預治療后,相比于 T細胞耗竭組,造血干細胞治療組和IL-2治療組具有逆轉T細胞耗竭的作用:細胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著升高(p<0.05);TB10.4特異性的記憶性 CD8+ T細胞的數量增加(p<0.05);CD4+ T細胞表面抑制性受體 PD-1表達水平下降(p<0.01);BCG攻擊后,造血干細胞治療組和IL-2治療組的細菌載量顯著低
8、于T細胞耗竭未治療組;CD34-Lin-Sca-1+CD117+造血干細胞的增殖能力恢復(p<0.05)。④通過造血干細胞增殖分化相關通路 JAK-STAT和 PI3K研究發(fā)現,激酶3(Janus Kinase3。JAK3)蛋白主要在造血細胞中表達,T細胞耗竭組中骨髓造血干細胞內轉錄因子STAT-5磷酸化水平被抑制,IL-2治療后可以恢復STAT-5的磷酸化。
結論:應用結核抗原持續(xù)刺激建立 T細胞耗竭動物實驗模型,該模型從一
9、個側面說明大量細菌(抗原)刺激是結核分枝桿菌引起機體免疫功能低下的機制之一;T細胞耗竭后小鼠受特異性抗原刺激時 IFN-γ等細胞因子分泌水平下降,CD4+和 CD8+T細胞數目和增殖能力下降,CD4+ T細胞表面抑制性受體PD-1表達上調,造血干細胞分化為 T細胞的能力降低;應用造血干細胞、IL-2治療后T細胞耗竭得以逆轉;進一步的研究發(fā)現 IL-2主要通過激活 JAK-STAT信號通路,使得轉錄因子 STAT-5磷酸化,調控造血干細胞
10、的增殖分化,從而恢復骨髓造血干細胞向T細胞分化的能力。
第二章:結核分枝桿菌融合蛋白LT70的構建及其保護效果研究。結核病由結核分枝桿菌感染引起,是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時間最久、危害最為嚴重的傳染病之一。二十世紀八十年代以來,隨著耐藥菌株尤其是耐多藥結核菌及人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus。HIV)的傳播與流行,結核病在世界各地的發(fā)病率呈現回升趨勢,發(fā)病率和死亡率高居不下?,F階段結核
11、病防治所使用的疫苗BCG是減毒牛分枝桿菌活疫苗。自1921年用于人類接種,能夠有效預防新生兒和兒童患嚴重的腦膜結核及全身粟粒性結核病,但是不能有效預防成人肺結核的發(fā)生。因此,新型結核疫苗的研究開發(fā)迫在眉睫。
目的:通過建立針對休眠菌在內的不同生長狀態(tài)的結核分枝桿菌有效的免疫應答,提高亞單位疫苗的免疫保護效力。
方法:⑴選用結核分枝桿菌生長期抗原 ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64的190-198位的氨基
12、酸多肽和潛伏期保護性抗原Hrp1(Rv2626c),構建無標簽融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)。⑵該融合蛋白在大腸埃希菌E. coli BL21菌株中進行表達;通過條件優(yōu)化,使該蛋白可溶性表達;進而利用疏水柱層析和分子篩層析方法對其進行純化。⑶將純化產物與佐劑二甲基三十六烷基銨(dimo-thylidioctyl ammonium bromide。DDA)和聚肌胞苷酸(
13、polyinosinic-polycytidylic acid。PolyI:C)混合制備結核亞單位疫苗LT70,分別在小鼠模型和家兔模型評價亞單位疫苗 LT70免疫學效應及保護效率,并進行BCG初免后亞單位疫苗的強化免疫策略研究。
結果:①LT70融合蛋白在大腸埃希菌E. coli BL21中可溶性表達,應用疏水柱 Butyl-FF層析和分子篩 G-75的純化方法成功將其分離純化。②在小鼠模型免疫學評價中,亞單位疫苗 LT70
14、誘導產生的抗原特異性 IFN-γ水平和抗體IgG1、IgG2c水平顯著高于 BCG組和 PBS組,具有較強的免疫原性。③疫苗免疫30周后進行結核分枝桿菌 H37Rv毒株氣霧攻擊,LT70疫苗顯示出較強的免疫保護力(5.4±0.38 Log10 CFU),其保護效果強于 BCG(6.01±0.33 Log10 CFU)和 PBS組(6.53±0.26 Log10 CFU);BCG初免后亞單位疫苗 LT70具有加強BCG的免疫效果(5.62
15、±0.64 Log10 CFU)(p=0.26)。
結論:結核亞單位 LT70疫苗可誘導較強的抗原特異性細胞和體液免疫應答;在小鼠模型中具有較好的清除和抑制結核分枝桿菌的作用,其保護效果強于BCG,有望成為結核病防治的有效候選疫苗。
第三章:結核亞單位疫苗DPC佐劑的研究及其應用。新型結核亞單位疫苗需要佐劑輔助以誘導較強的免疫應答。選擇適當的佐劑不僅提高免疫應答的水平,也可以改變免疫應答的類型。疫苗靶向細胞內病原體如
16、結核分枝桿菌,需要誘導細胞免疫應答,包括活化CD4 Th1型輔助T細胞和CD8細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte。CTL)。然而,當前在臨床上使用的佐劑只有鋁佐劑,該佐劑可促進Th2型體液免疫應答,無法引起Th1型細胞免疫應答。因此,研發(fā)新的可誘導Th1型細胞免疫應答的佐劑對結核疫苗的發(fā)展至關重要。我們在前期研究中,以陽離子脂質體DDA為基礎,聯合Toll樣受體3激動劑PolyI:C能誘導較強的Th1型細胞免疫
17、應答和較強的免疫保護效果。但是佐劑DDA-PolyI:C(簡稱DP)的穩(wěn)定性較差,易發(fā)生絮凝現象,無法滿足臨床疫苗的需要。
目的:我們在佐劑DP的基礎上,研究增強佐劑穩(wěn)定性的方法,以構建更加穩(wěn)定和有效的新型免疫佐劑,利于后期的研發(fā)和生產。
方法:⑴以佐劑DP為基礎,聯合不同輔料,通過粒徑和zeta電位等指標評價佐劑的理化性狀和穩(wěn)定性,從而篩選可增強佐劑DP穩(wěn)定性的輔料。⑵利用乳化-溶劑揮發(fā)法,將 DDA和 PolyI
18、:C聯合膽固醇制成陽離子脂質體佐劑DDA-PolyI:C-膽固醇(簡稱 DPC),并與融合蛋白 LT70聯合構建結核亞單位疫苗 LT70-DPC。⑶在C57BL/6小鼠模型上進行 LT70-DPC疫苗的免疫學評價和保護效率評價:0,2,4周進行LT70-DPC疫苗的免疫,末次免疫后6周進行免疫指標的檢測,30周后結核分枝桿菌 H37Rv菌株攻擊,攻擊10周后檢測保護效率。
結果:①使用膽固醇聯合DDA和PolyI:C構建新型疫
19、苗佐劑DPC。②通過佐劑的理化性狀分析結果顯示新型佐劑DPC較佐劑DP粒徑由約500nm降至約400nm,大小均一;同時,隨著膽固醇的加入,佐劑DP的Zeta電位由23.48(±2.93)升高至41.22(±4.04),佐劑 DP的穩(wěn)定性得以明顯提升。③將佐劑DPC與融合蛋白LT70聯合,構建結核亞單位疫苗LT70-DPC。通過C57BL/6小鼠模型進行免疫學評價,結果顯示 LT70-DPC疫苗和 LT70-DP疫苗均可誘導產生較高的抗
20、原特異性 IFN-γ水平和抗體 IgG1、IgG2c水平,其水平顯著高于BCG組和 PBS組(p<0.05)。④在小鼠保護效率實驗中,結核亞單位疫苗LT70-DPC具有較強的免疫保護力。LT70-DPC組肺部細菌載量(5.43±0.37 Log10 CFU)與疫苗LT70-DP組細菌載量(5.4±0.38 Log10 CFU)相當,均低于BCG組(6.01±0.33 Log10 CFU);同時,結核分枝桿菌H37Rv毒株攻擊后,疫苗 L
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 結核亞單位疫苗LT70-DPC安全性初步評價與融合蛋白MAR和MRA的構建.pdf
- 新型結核病亞單位疫苗的評價.pdf
- 結核桿菌抗原CD8+T細胞多表位“串珠式”肽疫苗研究.pdf
- 空腸彎曲菌亞單位疫苗誘導淋巴細胞活化的實驗研究.pdf
- CpG ODN作為結核分枝桿菌亞單位疫苗佐劑的研究.pdf
- 結核桿菌蛋白亞單位疫苗的免疫學評價.pdf
- 基于T細胞表位的HBV DNA疫苗及結核桿菌熱休克蛋白70的佐劑功能的研究.pdf
- 新型結核疫苗實驗研究.pdf
- 牛副結核分枝桿菌多組分亞單位疫苗的初步研究.pdf
- 卡介苗多糖核酸-DDA在結核亞單位疫苗中的佐劑效應研究.pdf
- 幽門螺桿菌多亞單位融合疫苗的實驗研究.pdf
- 胃癌-樹突狀細胞融合疫苗刺激T淋巴細胞抗胃癌SGC7901細胞的實驗研究.pdf
- 結核病患者結核抗原特異性T細胞免疫應答反應的研究.pdf
- 豬附紅細胞體亞單位疫苗的初步研究.pdf
- 新型結核病亞單位疫苗的制備和有效性評價及疫苗Ⅰ型過敏反應評價.pdf
- 肺結核患者外周血Tγδ17細胞的亞群分析以及結核桿菌抗原對誘導Tγδ17細胞分化的影響.pdf
- HCV多CTL表位樹突狀細胞疫苗的構建及體外刺激T細胞反應.pdf
- 重組豬瘟病毒T細胞表位的豬細小病毒樣顆粒亞單位疫苗研究.pdf
- 結核患者DC亞群的變化和結核桿菌抗原對DC成熟及調節(jié)γδT細胞功能的影響.pdf
- 結核桿菌抗原誘導活化的人γδT細胞凋亡機制探討.pdf
評論
0/150
提交評論