結核抗原持續(xù)刺激致T細胞耗竭實驗研究及亞單位疫苗LT70-DPC的研發(fā).pdf

1、本文對結核抗原持續(xù)刺激致T細胞耗竭實驗研究及亞單位疫苗LT70-DPC的研發(fā)進行了闡述。本研究分為三個部分：
　　第一章：結核抗原持續(xù)刺激致T細胞耗竭實驗研究。結核病是一種慢性感染性疾病，由結核分枝桿菌感染引起，是全球危害最為嚴重的傳染病之一。有研究報道嚴重的結核病患者CD4+T細胞，尤其是Th1細胞數目下降。我們也發(fā)現痰菌陽性的纖維空洞型結核病患者對結核分枝桿菌抗原的T細胞免疫應答能力低于密切接觸者和結核病新發(fā)病人。以上現象都提

2、示嚴重的結核分枝桿菌感染可能造成機體免疫功能低下，其發(fā)生機制值得深入研究。
　　目的：通過結核抗原持續(xù)刺激建立T細胞耗竭小鼠模型，分析抗原持續(xù)刺激在結核病T細胞耗竭中的作用及可能的機制和治療措施。
　　方法：⑴采用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin。BCG）免疫C57BL/6小鼠，用結核亞單位蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c（簡稱 LT70）聯合 M

3、tb10.4-HspX（簡稱 MH）反復免疫10次，模擬結核分枝桿菌抗原持續(xù)刺激的狀態(tài)，建立T細胞耗竭模型。⑵通過酶聯免疫斑點試驗和酶聯免疫吸附試驗分析脾臟T細胞IFN-γ和IL-2的分泌水平；通過流式細胞術檢測 CD4+、CD8+ T細胞數目；通過 TB10.44-12五聚體標記檢測TB10.4特異性的記憶性CD8+ T細胞數目；通過流式細胞術檢測CD4+/CD8+ T細胞表面程序性死亡受體1（Programmed Death1。PD

4、-1）的表達；通過 BCG和銅綠假單胞菌攻擊，檢測不同模型組保護效果差異；進一步檢測 CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數量和增殖能力。⑶在T細胞耗竭模型基礎上，應用造血干細胞、間充質干細胞、IL-2和雷帕霉素進行干預治療，檢測以下指標：抗原特異性細胞因子 IFN-γ和 IL-2的分泌水平；TB10.4特異性的記憶性CD8+T細胞的數量；CD4+T細胞表面抑制性受體PD-1的表達；BCG攻擊后的保護效果；CD34-L

5、in-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數量和增殖能力。通過上述指標檢測評價不同治療方案的治療效果。⑷在IL-2具有逆轉 T細胞耗竭作用的基礎上，進一步探索 IL-2與造血干細胞增殖分化相關信號通路 JAK-STAT和PI3K之間的關系，揭示IL-2逆轉T細胞耗竭的分子機制。
　　結果：①通過BCG免疫一次，結核亞單位疫苗 LT70和 MH加強免疫10次，成功建立T細胞耗竭模型。②相比于結核抗原短暫刺激（加強免疫2次）組。T細胞

6、耗竭組：細胞因子 IFN-γ和 IL-2的分泌水平顯著性降低（p<0.01）；CD4+、CD8+ T細胞數目顯著性減少（p<0.05）；TB10.44-12特異性的記憶性CD8+ T細胞數量顯著減少（p<0.05）；CD4+ T細胞表面抑制性受體 PD-1表達水平升高（p<0.05）；BCG和銅綠假單胞菌攻擊后清除率下降（p<0.05），機體抗感染保護能力明顯下降；CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數量降低，其增殖能

7、力被抑制（p<0.05）。③應用造血干細胞、間充質干細胞、IL-2和雷帕霉素進行干預治療后，相比于 T細胞耗竭組，造血干細胞治療組和IL-2治療組具有逆轉T細胞耗竭的作用：細胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著升高（p<0.05）；TB10.4特異性的記憶性 CD8+ T細胞的數量增加（p<0.05）；CD4+ T細胞表面抑制性受體 PD-1表達水平下降（p<0.01）；BCG攻擊后，造血干細胞治療組和IL-2治療組的細菌載量顯著低

8、于T細胞耗竭未治療組；CD34-Lin-Sca-1+CD117+造血干細胞的增殖能力恢復（p<0.05）。④通過造血干細胞增殖分化相關通路 JAK-STAT和 PI3K研究發(fā)現，激酶3（Janus Kinase3。JAK3）蛋白主要在造血細胞中表達，T細胞耗竭組中骨髓造血干細胞內轉錄因子STAT-5磷酸化水平被抑制，IL-2治療后可以恢復STAT-5的磷酸化。
　　結論：應用結核抗原持續(xù)刺激建立 T細胞耗竭動物實驗模型，該模型從一

9、個側面說明大量細菌（抗原）刺激是結核分枝桿菌引起機體免疫功能低下的機制之一；T細胞耗竭后小鼠受特異性抗原刺激時 IFN-γ等細胞因子分泌水平下降，CD4+和 CD8+T細胞數目和增殖能力下降，CD4+ T細胞表面抑制性受體PD-1表達上調，造血干細胞分化為 T細胞的能力降低；應用造血干細胞、IL-2治療后T細胞耗竭得以逆轉；進一步的研究發(fā)現 IL-2主要通過激活 JAK-STAT信號通路，使得轉錄因子 STAT-5磷酸化，調控造血干細胞

10、的增殖分化，從而恢復骨髓造血干細胞向T細胞分化的能力。
　　第二章：結核分枝桿菌融合蛋白LT70的構建及其保護效果研究。結核病由結核分枝桿菌感染引起，是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時間最久、危害最為嚴重的傳染病之一。二十世紀八十年代以來，隨著耐藥菌株尤其是耐多藥結核菌及人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus。HIV）的傳播與流行，結核病在世界各地的發(fā)病率呈現回升趨勢，發(fā)病率和死亡率高居不下?，F階段結核

11、病防治所使用的疫苗BCG是減毒牛分枝桿菌活疫苗。自1921年用于人類接種，能夠有效預防新生兒和兒童患嚴重的腦膜結核及全身粟粒性結核病，但是不能有效預防成人肺結核的發(fā)生。因此，新型結核疫苗的研究開發(fā)迫在眉睫。
　　目的：通過建立針對休眠菌在內的不同生長狀態(tài)的結核分枝桿菌有效的免疫應答，提高亞單位疫苗的免疫保護效力。
　　方法：⑴選用結核分枝桿菌生長期抗原 ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64的190-198位的氨基

12、酸多肽和潛伏期保護性抗原Hrp1（Rv2626c），構建無標簽融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c（LT70）。⑵該融合蛋白在大腸埃希菌E. coli BL21菌株中進行表達；通過條件優(yōu)化，使該蛋白可溶性表達；進而利用疏水柱層析和分子篩層析方法對其進行純化。⑶將純化產物與佐劑二甲基三十六烷基銨（dimo-thylidioctyl ammonium bromide。DDA）和聚肌胞苷酸（

13、polyinosinic-polycytidylic acid。PolyI:C）混合制備結核亞單位疫苗LT70，分別在小鼠模型和家兔模型評價亞單位疫苗 LT70免疫學效應及保護效率，并進行BCG初免后亞單位疫苗的強化免疫策略研究。
　　結果：①LT70融合蛋白在大腸埃希菌E. coli BL21中可溶性表達，應用疏水柱 Butyl-FF層析和分子篩 G-75的純化方法成功將其分離純化。②在小鼠模型免疫學評價中，亞單位疫苗 LT70

14、誘導產生的抗原特異性 IFN-γ水平和抗體IgG1、IgG2c水平顯著高于 BCG組和 PBS組，具有較強的免疫原性。③疫苗免疫30周后進行結核分枝桿菌 H37Rv毒株氣霧攻擊，LT70疫苗顯示出較強的免疫保護力（5.4±0.38 Log10 CFU），其保護效果強于 BCG（6.01±0.33 Log10 CFU）和 PBS組（6.53±0.26 Log10 CFU）；BCG初免后亞單位疫苗 LT70具有加強BCG的免疫效果（5.62

15、±0.64 Log10 CFU）（p=0.26）。
　　結論：結核亞單位 LT70疫苗可誘導較強的抗原特異性細胞和體液免疫應答；在小鼠模型中具有較好的清除和抑制結核分枝桿菌的作用，其保護效果強于BCG，有望成為結核病防治的有效候選疫苗。
　　第三章：結核亞單位疫苗DPC佐劑的研究及其應用。新型結核亞單位疫苗需要佐劑輔助以誘導較強的免疫應答。選擇適當的佐劑不僅提高免疫應答的水平，也可以改變免疫應答的類型。疫苗靶向細胞內病原體如

16、結核分枝桿菌，需要誘導細胞免疫應答，包括活化CD4 Th1型輔助T細胞和CD8細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte。CTL）。然而，當前在臨床上使用的佐劑只有鋁佐劑，該佐劑可促進Th2型體液免疫應答，無法引起Th1型細胞免疫應答。因此，研發(fā)新的可誘導Th1型細胞免疫應答的佐劑對結核疫苗的發(fā)展至關重要。我們在前期研究中，以陽離子脂質體DDA為基礎，聯合Toll樣受體3激動劑PolyI:C能誘導較強的Th1型細胞免疫

17、應答和較強的免疫保護效果。但是佐劑DDA-PolyI:C（簡稱DP）的穩(wěn)定性較差，易發(fā)生絮凝現象，無法滿足臨床疫苗的需要。
　　目的：我們在佐劑DP的基礎上，研究增強佐劑穩(wěn)定性的方法，以構建更加穩(wěn)定和有效的新型免疫佐劑，利于后期的研發(fā)和生產。
　　方法：⑴以佐劑DP為基礎，聯合不同輔料，通過粒徑和zeta電位等指標評價佐劑的理化性狀和穩(wěn)定性，從而篩選可增強佐劑DP穩(wěn)定性的輔料。⑵利用乳化-溶劑揮發(fā)法，將 DDA和 PolyI

18、:C聯合膽固醇制成陽離子脂質體佐劑DDA-PolyI:C-膽固醇（簡稱 DPC），并與融合蛋白 LT70聯合構建結核亞單位疫苗 LT70-DPC。⑶在C57BL/6小鼠模型上進行 LT70-DPC疫苗的免疫學評價和保護效率評價：0，2，4周進行LT70-DPC疫苗的免疫，末次免疫后6周進行免疫指標的檢測，30周后結核分枝桿菌 H37Rv菌株攻擊，攻擊10周后檢測保護效率。
　　結果：①使用膽固醇聯合DDA和PolyI:C構建新型疫

19、苗佐劑DPC。②通過佐劑的理化性狀分析結果顯示新型佐劑DPC較佐劑DP粒徑由約500nm降至約400nm，大小均一；同時，隨著膽固醇的加入，佐劑DP的Zeta電位由23.48（±2.93）升高至41.22（±4.04），佐劑 DP的穩(wěn)定性得以明顯提升。③將佐劑DPC與融合蛋白LT70聯合，構建結核亞單位疫苗LT70-DPC。通過C57BL/6小鼠模型進行免疫學評價，結果顯示 LT70-DPC疫苗和 LT70-DP疫苗均可誘導產生較高的抗

20、原特異性 IFN-γ水平和抗體 IgG1、IgG2c水平，其水平顯著高于BCG組和 PBS組（p<0.05）。④在小鼠保護效率實驗中，結核亞單位疫苗LT70-DPC具有較強的免疫保護力。LT70-DPC組肺部細菌載量（5.43±0.37 Log10 CFU）與疫苗LT70-DP組細菌載量（5.4±0.38 Log10 CFU）相當，均低于BCG組（6.01±0.33 Log10 CFU）；同時，結核分枝桿菌H37Rv毒株攻擊后，疫苗 L