miR-200a通過介導ZEB1-2的表達來調控TGF-β1誘導的腹膜間皮細胞上皮間質轉分化過程.pdf

1、目的：
　　通過基因技術尋找到與腹膜透析相關性腹膜纖維化相關聯(lián)的miRNA，體內及體外實驗驗證其表達變化，明確該miRNA是否參與到腹膜纖維過程。并通過RNA干擾技術，觀察 miRNA對腹膜纖維化關鍵環(huán)節(jié)腹膜間皮細胞間質轉分化的影響。通過miRNA靶基因預測網(wǎng)站，篩選miR-200a下游作用靶基因，觀察miR-200a對其調控作用，探討miR-200a對腹膜間皮細胞EMT的調控機制。
　　方法：
　　1、體內實驗：隨機

2、選取6只雄性SD大鼠，平均分為對照組及實驗組。實驗組：腹腔注射脂多糖（LPS）+高糖腹透液液，從而構建腹膜纖維化小鼠模型；對照組：腹腔注射生理鹽水。通過基因芯片法檢測小鼠腹膜組織miRNA相關表達譜，尋找相關差異表達的miRNAs。再通過擴大實驗樣本量，利用real time PCR法驗證差異 miRNA（miR?200a）表達水平是否與基因芯片結果相符。2、體外實驗：利用轉化生長因子β（TGF?β1）刺激腹膜間皮細胞，建立體外上皮細胞

3、?間充質轉分化（EMT）模型，分別用 Western印跡、細胞免疫熒光、PCR等實驗方法來檢測人腹膜間皮細胞中Ⅰ型膠原（Col?Ⅰ）、α平滑肌肌動蛋白（α?SMA）、纖維連接蛋白（FN）、E鈣黏蛋白（E?cadherin）的表達變化及定位，real timePCR及Taqman探針法檢測腹膜間皮間皮細胞EMT模型中miR?200a的表達水平的變化；采取RNA干擾技術，利用miR-200a mimics及inhibit干預細胞，觀察其潛在

4、靶基因ZEB1/2表達變化及EMT變化。
　　結果：
　　1、體內實驗示：基因芯片結果顯示，有差異表達的miRNA表達譜中，有8個miRNA差異倍數(shù)大于等于2倍，而在這8個miRNA中，可見miR?200a的表達明顯下調（差異倍數(shù)為3.31倍，P﹤0.05）。擴大實驗樣本量，即實驗組及對照組各15只大鼠，qRT?PCR驗證了miR?200a在腹膜組織中的表達量，實驗組較對照組下調2.55倍（P﹤0.05）；2、體外實驗示：體

5、外EMT模型中發(fā)現(xiàn)：①、分別利用不同濃度TGF?β1刺激細胞及作用不同時間時，腹膜間皮細胞EMT過程出現(xiàn)濃度及時間依賴效應，即Ⅰ型膠原（Col?Ⅰ）、α平滑肌肌動蛋白（α?SMA）、纖維連接蛋白（FN）的表達量隨著TGF?β1刺激的濃度及時間遞增而增加，同時，E鈣黏蛋白（E?cadherin）的表達量反而降低；②、分別利用TGF?β1刺激細胞不同時間后，miR?200a表達水平均明顯下調（P﹤0.05）；③、與對照組對比，miR-200

6、a mimics轉染至細胞后，抑制EMT進展；而miR-200a inhibit轉染至細胞后，促進EMT進展；④、使用miRNA靶基因預測網(wǎng)站（miRBase、TargetScan、TarBase、miRanda），篩選miR-200a潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)ZEB1/2可能為miR-200a下游靶基因，參與腹膜間皮細胞 EMT過程；⑤、分別利用不同濃度TGF?β1刺激細胞及作用不同時間時，ZEB家族，即ZEB1和ZEB2的表達量隨著TGF?β