雙酚A對雄激素調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的影響.pdf

1、目的:
　　雙酚A(Bisphenol A，BPA)是一種廣泛使用于塑料制品的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。BPA能經(jīng)由食品以及飲料進入到人體，也可以從垃圾滲析到周圍的生態(tài)環(huán)境中而對健康產(chǎn)生危害。大量研究發(fā)現(xiàn)BPA能夠影響激素的合成和代謝，受體的表達以及基因的活性，然而以往的研究多集中在其雌激素活性上。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)無論是圍生期、青春期還是成年期BPA暴露均性別依賴性地損傷雄性小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶以及被動回避記憶能力。與雌激素對雌性動物的

2、重要作用一樣，雄激素對雄性的認(rèn)知功能以及突觸形成具有重要的調(diào)節(jié)作用。近來研究發(fā)現(xiàn)BPA能拮抗雄激素受體(AR)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。所以，本實驗旨在探究BPA暴露性別特異性地損傷雄性小鼠學(xué)習(xí)記憶行為是否與其干擾雄激素對雄鼠學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。
　　突觸可塑性與空間學(xué)習(xí)記憶行為密切相關(guān)。性激素能通過影響海馬和前額葉皮層中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸重塑而影響認(rèn)知行為。有研究發(fā)現(xiàn)睪丸摘除導(dǎo)致雄性小鼠海馬突觸密度降低，在補充丙酸睪酮(TP)或二氫睪酮

3、(DHT)后，突觸密度顯著增加。突觸界面是一個對化學(xué)物質(zhì)非常敏感的結(jié)構(gòu)，突觸間隙、突觸活性帶長度、突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)和突觸界面曲率等可因外界刺激而發(fā)生改變。PSD上分布著大量的腳手架蛋白以及一些與突觸傳遞相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，其中很多是與后膜上受體通道相關(guān)聯(lián)，這些蛋白表達水平的改變以及彼此間的相互作用都能影響突觸的活性和突觸可塑性，同時也導(dǎo)致PSD厚度的變化。
　　本研究通過建立成年去勢雄鼠

4、模型，將性腺完整、去勢、去勢后補充雄激素的雄鼠分別暴露于BPA，研究長期BPA暴露對成年雄鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響，進一步電鏡觀測雄鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的突觸密度以及突觸界面結(jié)構(gòu)的改變;最后通過Western blot檢測海馬突觸蛋白SynapsinⅠ和PSD-95，興奮性氨基酸NMDA受體以及信號通路蛋白ERK1/2、p38及其磷酸化表達的改變，探討B(tài)PA暴露影響雄鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為和突觸可塑性的可能機制。
　　方法:
　　清

5、潔級8周齡的ICR雄性小鼠，購買于浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。飼養(yǎng)的環(huán)境為自然光照和黑暗12h交替，飼養(yǎng)室的溫度控制在23±2℃，50％-60％的濕度控制，水以及食物均能自由取食。適應(yīng)環(huán)境一周后，水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，然后進行睪丸摘除術(shù)建立去勢模型。術(shù)后恢復(fù)2周之后，每天進行頸背部皮下注射染毒:丙酸睪酮(TP，0.5 mg/kg/day)，BPA(0.4，4 mg/kg/day)，TP+BPA(0.4或4 mg/kg

6、/day)，金龍魚食用油（50μL/day），為期45天。給藥結(jié)束3天后，每組取14只進行行為檢測，6只制作海馬超薄切片進行海馬突觸形態(tài)測定，4只用于測定相關(guān)蛋白，8只用于測定腦和血清雄激素水平。
　　實驗所有的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。水迷宮4天訓(xùn)練結(jié)果采用重復(fù)三因素方差分析，水迷宮第5天結(jié)果、突觸形態(tài)測定結(jié)果采用雙因素方差分析，雄激素水平以及Western blot的蛋白結(jié)果采用單因素方

7、差分析。
　　結(jié)果:
　　1.與假手術(shù)對照組相比，性腺摘除顯著降低血清和腦內(nèi)雄激素水平(p＜0.001;p＜0.001)，當(dāng)補充TP后，血清和腦雄激素水平上升(p＜0.001; p＜0.001)。BPA（0.4，4mg/kg/day）暴露不影響性腺摘除鼠血清和腦中雄激素水平，但是顯著降低假手術(shù)組小鼠血清(p＜0.05; p＜0.01)和腦(p＜0.05; p＜0.01)雄激素的水平和TP補充小鼠血清(p＜0.05)和腦(p＜

8、0.05; p＜0.01)雄激素水平。
　　2.水迷宮4天的訓(xùn)練結(jié)果表明:與假手術(shù)對照組相比，性腺摘除顯著延長第4天小鼠找到平臺的潛伏期(p＜0.05)，TP補充后，找到平臺的潛伏期縮短(p＜0.05)，表明雄激素缺失明顯損傷空間學(xué)習(xí)能力。BPA暴露沒有延長去勢小鼠找到平臺的潛伏期(p＞0.05)，但顯著延長假手術(shù)組(4 mg/kg/day，p＜0.01)和TP補充組(0.4 mg/kg/day，p＜0.05)小鼠找到平臺的潛伏期

9、。水迷宮第5天的結(jié)果表明，BPA暴露降低假手術(shù)組小鼠（0.4mg/kg/day，p＜0.05）和TP補充組小鼠(p＜0.001;p＜0.01)在目標(biāo)象限停留的時間百分比，但不影響睪丸摘除小鼠目標(biāo)象限停留的時間百分比。這些結(jié)果表明BPA損傷成年小鼠空間記憶能力，能抑制雄激素對性腺摘除誘導(dǎo)的空間記憶損傷的恢復(fù)作用。
　　3.突觸密度結(jié)果顯示，性腺摘除顯著降低成年雄鼠海馬CA1區(qū)突觸密度(p＜0.001)，TP補充后突觸密度顯著提高(p

10、＜0.001)。BPA（0.4，4 mg/kg/day）暴露降低假手術(shù)組海馬CA1區(qū)突觸密度(p＜0.001，p＜0.001)，但對性腺摘除組沒有影響。BPA(0.4，4 mg/kg/day)暴露抑制TP誘導(dǎo)的突觸密度增多(p＜0.01，p＜0.001)。與假手術(shù)對照組相比，性腺摘除顯著縮短活性帶長度(p＜0.01)，減小PSD厚度(p＜0.001)，增大突觸間隙寬度(p＜0.001)，但TP補充后這種變化被BPA逆轉(zhuǎn)(p＜0.05，p

11、＜0.05，p＜0.001)。BPA暴露對假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)的影響與TP補充組相似。這些結(jié)果表明BPA暴露能抑制雄激素的誘導(dǎo)的海馬突觸的形成和結(jié)構(gòu)修飾。
　　4.進一步的Western blot分析顯示，BPA尤其在4 mg/kg/day的劑量，顯著下調(diào)假手術(shù)組小鼠海馬synapsinⅠ(p＜0.05)，PSD-95(p＜0.01)，NR2B(p＜0.05)的表達。性腺摘除微弱下調(diào)synapsinⅠ，但顯著下調(diào)PSD-95(p＜0.

12、05)、NR2B(p＜0.01)的表達，在補充TP之后這些蛋白表達上調(diào)(p＜0.05，p＜0.05)。BPA暴露抑制TP誘導(dǎo)對synapsinⅠ(p＜0.01)，PSD-95(p＜0.05)，NR2B(p＜0.05)的上調(diào)作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，性腺摘除和BPA暴露對p38和ERK1/2的表達沒有影響，但是4 mg/kg/day的BPA暴露顯著下調(diào)ERK1/2的磷酸化(p-ERK1/2)水平(p＜0.05)并上調(diào)p-p38的磷酸化(p-p

13、38)(p＜0.001)。BPA暴露抑制TP誘導(dǎo)的p-ERK1/2上調(diào)(p＜0.01)和p-p38下調(diào)(p＜0.01)。這些結(jié)果表明BPA暴露抑制雄激素誘導(dǎo)的突觸蛋白和NR2B的表達，抑制MAPK/ERKs并促進MAPK/p38信號通路的活性。
　　結(jié)論:
　　長期暴露于BPA性別特異性地損傷雄性動物的學(xué)習(xí)記憶功能可能與BPA的抗雄激素作用有關(guān)。該作用可能一方面通過降低腦內(nèi)雄激素水平，并干擾雄激素對ERKs和p38信號通路的