金黃色葡萄球菌CapB2的致病作用及表達調控機制研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌是常見的條件致病菌，能夠表達大量的毒力蛋白，可導致多種臨床疾病，而金黃色葡萄球菌的毒力由眾多調控因子所調控的毒力基因所決定。莢膜多糖（capsular polysaccharide，CP）的產生與金黃色葡萄球菌的致病力有關，是金黃色葡萄球菌一種重要的免疫逃逸機制，其中capB2是合成莢膜多糖的重要組成部分，其致病作用受到廣泛重視。葡萄球菌輔助調控因子（Staphylococcal accessory re

2、gularA，sarA）在調控金黃色葡萄球菌毒力方面的作用非常重要。本研究旨在為了解CapB2在金黃色葡萄球菌致病方面的作用及其表達調控機制。
　　方法：
　　利用PCR法擴增金黃色葡萄球菌臨床分離株75(SA75)莢膜多糖的型特異性區(qū)域對SA75進行莢膜多糖基因分型。PCR擴增SA75的capB2基因上、下游同源臂，通過特定的酶切位點連接不含目的基因的上、下游片段，然后通過同源重組反應構建質粒pKOR1-△capB2，將重

3、組質粒轉入大腸埃希菌DC10B進行修飾，再電轉入SA75菌株中。經過變溫傳代和四環(huán)素的誘導，篩選出capB2基因缺失突變菌株（△capB2）。利用PCR、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)和基因測序對△capB2篩選子進行鑒定。分別擴增含啟動子和核糖體結合位點(Ribosome Binding Site，RBS)的sarA基因全長和capB2基因的編碼區(qū)序列，選擇合適的酶切位點將回復基因

4、與質粒pRB473連接，將重組回復質粒熱轉轉入大腸埃希菌DC10B感受態(tài)細胞中，最后轉入△ capB2和sarA缺失突變株(△sarA)中，經qPCR和測序鑒定回復成功。待基因缺失突變株及互補表達株構建成功，建立皮膚膿腫模型比較△ capB2、△ capB2-C與野生株之間的毒力差異，確定capB2在金黃色葡萄球菌致病中的作用，并取膿液標本進行電鏡觀察，分析各組細菌間微莢膜厚度差異。使用qPCR的方法檢測調控因子sarA與金黃色葡萄球菌

5、capB2基因間的調控關系。
　　結果：
　　莢膜基因分型結果經測序證實本實驗所使用的SA75屬于8型莢膜多糖(CP8)。將capB2上、下游1500 bp片段先后與克隆載體pET28a連接，通過同源重組反應構建pKOR1-△capB2重組質粒，轉入大腸埃希菌DC10B，最后電轉入SA75菌株中發(fā)生同源重組，經篩選、測序確證后得到△capB2?；蛉笔蛔冎旰突パa表達株構建成功后，繪制野生株、缺失突變株和互補表達株的生長曲線

6、，發(fā)現(xiàn)各菌株之間的生長曲線并無明顯差異。通過皮膚膿腫模型實驗研究capB2基因所編碼的蛋白的功能。研究結果發(fā)現(xiàn)于感染的第4、5、6、7天，細菌△capB2組的膿腫面積明顯小于野生株SA75組，回復了capB2基因的互補表達株△capB2-C組的膿腫面積恢復到野生株水平。感染的第二至第十天，敲除株和互補表達株之間的膿腫面積差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，整個感染過程中野生株和回復突變株之間的差異均不明顯(P＞0.05)。電鏡結果顯示

7、，△capB2組的微莢膜厚度最薄，互補表達株△ capB2-C組的微莢膜厚度恢復到接近野生株組水平。在調控關系上，提取△sarA、△sarA-C和野生株SA75細菌總RNA，qPCR檢測各菌株capB2基因表達水平的差異。我們發(fā)現(xiàn)與野生株相比，△sarA株中capB2表達量上調326倍，而回復了sarA基因的△sarA-C，capB2的表達水平恢復到接近野生株水平，提示sarA能抑制capB2基因的表達，對capB2具有負調控的作用。<