白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌標準株的抑菌作用及機制研究.pdf

1、目的:白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是植物遇真菌侵襲時分泌的一種植物防御成分，屬天然多酚類物質。1940年從植物白藜蘆根莖里提取并命名為Resveratrol。含RES的植物資源豐富，葡萄藤、虎杖等植物都可加工提純RES，廢棄植物如花生根、葡萄皮等也含有RES。RES具有抗癌、免疫調節(jié)、預防心血管疾病、抗氧化、抗病毒等多種生物學活性，對多種微生物也具有抑制作用，但抑菌機制尚不明確。幾十年來，臨床病原菌耐藥性不斷增加，尤其是多

2、重耐藥的金黃色葡萄球菌讓臨床醫(yī)師選擇抗生素難上加難，副作用小且價格低廉的中藥可作為輔助藥物供臨床選擇。本研究選用金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923(簡稱金葡菌標準株)作為研究主體，通過觀察分析RES作用金葡菌標準株后，其最低抑菌濃度、生長曲線、細胞膜通透性、超微結構等指標的變化，研究RES對金葡菌標準株抑菌作用及抑菌機制，為RES進一步開發(fā)應用提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1 RES對金葡菌標準株最低抑菌濃度測定

3、和生長曲線觀察:
　　本研究以金葡菌標準株(ATCC25922)作為研究主體，以臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的M7-A5為標準方法，采用抗生素敏感性實驗的微量肉湯稀釋法，檢測RES對金葡菌標準株的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC);通過繪制在含不同濃度RES培養(yǎng)液中金葡菌標準株的生長

4、曲線，觀察在不含RES、含DMSO和含RES為1/4 MIC，1/2 MIC，1MIC和2MIC濃度下的金葡菌標準株生長情況，研究RES對金葡菌標準株的抑制作用。
　　2 RES對金葡菌標準株細胞膜通透性的影響:
　　2.1 RES對金葡菌標準株作用后培養(yǎng)液上清電導率數(shù)據(jù)分析LB肉湯接種金葡菌標準株懸液，37℃搖床震蕩孵育，在進入對數(shù)生長前期，加入RES，得到含RES為1 MIC和2 MIC的培養(yǎng)液，不加RES組作為對照組，

5、繼續(xù)37℃搖床震蕩孵育，分別在作用0h、2h、4h、6h、7h、8h時，取混勻培養(yǎng)液2ml，離心，取上清，稀釋，檢測上清的電導率，每個樣本檢測三次，取均值繪制曲線圖，分析在不同濃度RES作用下，金葡菌標準株培養(yǎng)液上清液電導率的變化。
　　2.2 RES作用于金葡菌標準株后培養(yǎng)液在260 nm和280 nm處吸光度分析:LB肉湯接種等量金葡菌標準株菌懸液，37℃搖床震蕩孵育，在進入對數(shù)生長期前，加入RES獲得含RES為1 MIC的培

6、養(yǎng)液，37℃搖床震蕩孵育，在0h、2h、4h、6h、7h、8h作用時間點，分別取培養(yǎng)液2ml，以不加RES的培養(yǎng)液作對照，檢測培養(yǎng)液OD260，OD280的數(shù)據(jù)并比較分析。
　　2.3 RES作用于金葡菌標準株后培養(yǎng)液在630 nm處吸光度變化分析:LB肉湯接種金葡菌標準菌株懸液，37℃搖床震蕩孵育，在進入對數(shù)生長期前，加入RES配制成含RES1 MIC的培養(yǎng)液，37℃搖床震蕩孵育，在0h、2h、4h、6h、7h、8h分別檢測培養(yǎng)

7、菌液在OD630的變化，不含RES的培養(yǎng)液作對照。
　　3金葡菌標準株超微結構變化:采用含藥平板接種法制備電鏡標本，含藥平板的最終藥物濃度為0.256 mg/ml，接種金葡菌標準株，37℃孵育18～24小時，按照常規(guī)方法制備掃描和透射顯微鏡樣品。通過透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察RES對金葡菌標準株超微結構的影響。
　　結果:
　　1 RES對金葡菌標準株的MIC為0.256 mg/ml;含DMSO組的生長曲線與不

8、含RES的生長曲線基本一致，排除了DMSO對金葡菌標準株的影響，在RES濃度為1/4 MIC和1/2 MIC時，金葡菌標準株生長受抑，生長曲線不典型，對數(shù)生長期變緩;RES濃度為1 MIC和2MIC時金葡菌標準株生長完全受抑制，生長曲線趨于平坦，說明金葡菌標準株生長受到抑制(Fig.1)。
　　2 RES對金葡菌標準株菌體細胞膜透性影響
　　2.1 RES作用金葡菌標準株后培養(yǎng)液上清的電導率改變(Table1和Fig.2)含

9、1 MIC的RES培養(yǎng)液作用金葡菌標準株后，培養(yǎng)液上清的電導率在0h、2h、4h、6h、7h、8h時間點分別為1.13 ms/cm，1.40 ms/cm，1.51 ms/cm，1.73 ms/cm，1.77 ms/cm，1.74 ms/cm;含2 MIC的RES的培養(yǎng)液作用金葡菌標準株后，上清液電導率分別為:1.16 ms/cm，1.45 ms/cm，1.58 ms/cm，1.87 ms/cm，1.93 ms/cm，1.97 ms/cm

10、，對照組培養(yǎng)液上清電導率分別為1.13 ms/cm,1.23 ms/cm,1.28 ms/cm、1.29 ms/cm,1.33 ms/cm,1.23 ms/cm,數(shù)據(jù)采用軟件Spss13.0進行重復性方差分析，實驗組和對照組有顯著性差異，證明了RES對金葡菌標準株的細胞膜通透性有影響，造成菌體內電解質的大量外泄，導致菌體外培養(yǎng)液的電解質濃度明顯高于未被藥物作用的培養(yǎng)液，尤其是對數(shù)生長期后，電導率改變更加明顯。
　　2.21 M I

11、C的RES作用金葡菌標準株后培養(yǎng)液在260nm處吸光度的改變(Table2和Fig.3)檢測含1 MIC RES培養(yǎng)液作用金葡菌標準株后在0h、2h、4h、6h、7h、8h時間點的吸光度值，實驗組培養(yǎng)液的OD260分別為:0.832、1.106、1.138、1.117、1.989，2.769;對照組培養(yǎng)液OD260分別為0.802、0.884、0.850、0.812、1.544、1.893，實驗組OD260明顯高于對照組(P＜0.05)

12、。實驗組培養(yǎng)液在OD280數(shù)據(jù)分別是(Table3和Fig.4):0.811、1.093、1.122、1.136、1.766、2.629;對照組培養(yǎng)菌液OD280分別是0.601、0.609、1.078、1.235、1.493、2.180。實驗組OD260和OD280明顯高于對照組（Spss13.0進行重復性方差分析，P＜0.05），進一步說明RES對金葡菌標準株細胞膜通透性有影響，導致大分子核酸和蛋白質等物質由菌體內外泄至培養(yǎng)液。

13、r>　　2.3含RES培養(yǎng)液作用金葡菌標準株后在630nm處吸光度改變(Table4和Fig.5)含1 MIC的RES的LB肉湯培養(yǎng)接種金葡菌標準株后，培養(yǎng)液在0h、2h、4h、6h、8h時OD630的吸光度分別是0.137，0.310，1.149，1.726，1.991，2.270，對照組分別是0.137，0.303，0.385，0.437，0.447，0.423，將數(shù)據(jù)繪制曲線，對照組曲線為正常細菌典型生長曲線，經(jīng)過緩沖期、對數(shù)增長

14、期和平臺期，實驗組曲線一直處于平緩狀態(tài)。經(jīng)Spss13.0進行重復性方差分析，實驗組OD630和對照組OD630有顯著性差異，P＜0.05。證實了1 MIC的RES完全抑制了金葡菌標準株的生長。3透射電鏡觀察顯示，RES對金葡菌標準株作用后，與對照組(Fig.6)相比，金葡菌標準株菌體細胞形態(tài)變形嚴重，菌體大小不一，菌體邊界粗糙不圓潤，細胞壁缺損并有破裂，邊緣疏松不光滑，細胞膜變薄，菌體內結構松散，胞漿內基質深淺不一，核膜斷裂，細胞器結

15、構模糊，細胞漿內含物稀薄，局部呈現(xiàn)空泡化特征，菌體細胞形態(tài)超微結構有明顯破壞和抑制作用。掃描電鏡觀察RES處理過的細菌大小不一，細胞分裂受阻，形態(tài)不規(guī)則，細胞表面出現(xiàn)皺褶，周圍多棘狀突起（Fig.7）。
　　結論:本研究證實了RES對金葡菌標準株的抑制作用的機制是通過破壞金葡菌細胞膜結構或功能，導致細胞膜通透性的改變，使細胞內容物如各類無機鹽離子、大分子核酸、大分子蛋白質等物質由菌體內外泄至培養(yǎng)液，菌體內外物質的失衡，導致細菌菌體