耐鹽堿基因PrxQ的分離、克隆及表達(dá)研究.pdf

1、高鹽是限制作物生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量的主要脅迫之一。當(dāng)前，全球人口不斷增加，20％的灌溉農(nóng)業(yè)遭受鹽脅迫，培育高抗鹽的植物新品種，開(kāi)發(fā)利用鹽堿地，已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的全球性問(wèn)題。
　　 本實(shí)驗(yàn)從鹽地堿蓬上提取總RNA，以該RNA為模板通過(guò)RT-PCR合成cDNA，設(shè)計(jì)目的基因PrxQ的PCR-up/PCR-dn引物后，用PCR法擴(kuò)增PrxQ基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物是過(guò)氧還蛋白Q—新發(fā)現(xiàn)的抗氧化蛋白之一。為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)方便，我們構(gòu)建pBS-

2、TⅡ-PrxQ載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)PCR和酶切驗(yàn)證后，我們將其送出測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，以確保下一步實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性。
　　 基于研究PrxQ基因提高生物耐鹽堿能力的程度，我們構(gòu)建了酵母表達(dá)載體。用pPIC9k-PrxQ-up/pPIC9k-PrxQ-dn做引物，以pBS-TⅡ-PrxQ為模板，在PrxQ基因上添加酶切位點(diǎn)EcoRI和NotⅠ。然后，我們運(yùn)用質(zhì)粒pPIC9k構(gòu)建載體pPIC9k-PrxQ，經(jīng)PCR和酶

3、切驗(yàn)證后，用熱激法轉(zhuǎn)化畢氏酵母，利用畢氏酵母的表達(dá)系統(tǒng)研究PrxQ基因的功能。經(jīng)過(guò)組氨酸缺陷篩選和菌落PCR檢驗(yàn)后，在NaCl濃度分別為0mol/L，0.3mol/L，0.6 mol/L，0.9 mol/L，1.0 mol/L，1.2 mol/L，1.3mol/L，1.4mol/L的液體YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，挑選耐鹽堿能力較強(qiáng)的陽(yáng)性克隆與未轉(zhuǎn)化菌株做對(duì)照，證實(shí)PrxQ基因能夠提高了畢氏酵母約的耐鹽堿性，約20％。但可能由于質(zhì)粒pPIC