初次RSV感染時間影響成年期再次感染時γδT細胞介導(dǎo)的氣道炎癥.pdf

1、目的：
　　嬰幼兒期嚴重RSV感染與兒童及成年期哮喘密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期小鼠相比，初次感染發(fā)生在新生期的小鼠成年期再次感染引起更為嚴重的全身癥狀和氣道炎癥，提示初次RSV感染時間決定再次感染時的疾病嚴重程度，但新生期初次RSV感染通過何種機制影響成年期再次感染時氣道炎癥反應(yīng)目前尚不十分清楚。
　　呼吸道黏膜系統(tǒng)的γδT細胞位于免疫防御第一道防線，在呼吸道黏膜局部抗感染免疫及免疫調(diào)節(jié)方面起作用。在抗

2、感染免疫的初次應(yīng)答中，γδT細胞可因抗原性質(zhì)的不同而分泌不同類型的細胞因子，進而調(diào)控免疫應(yīng)答的類型。我們前期研究工作亦發(fā)現(xiàn)，致敏前RSV感染明顯降低致敏鼠肺組織γδT細胞數(shù)量，并伴隨Th2型細胞因子及血清特異性IgE，IgG1水平的下降，推測γδT細胞及其所分泌的細胞因子在RSV感染所致肺組織炎性病變及喘息發(fā)作方面起重要作用。然而，γδT細胞在初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)中具有怎樣的生物學作用及其作用機

3、制如何，目前尚不清楚。本研究利用初次RSV感染發(fā)生在不同年齡段，再次感染發(fā)生在成年期的模型鼠，探討在初次RSV感染時間對再次感染后氣道炎癥發(fā)生發(fā)展影響過程中，γδT細胞的作用以及免疫應(yīng)答調(diào)控機制，為揭示新生期初次RSV感染與兒童期哮喘的相關(guān)性以及進一步理解γδT細胞在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　1、主要試劑
　　PBS、Diff-Quick染液、HE染液、PAS染液、膠原

4、酶D(Sigma)、Dnsae I(Sigma)、水合氯醛、胎牛血清(TBD)、胰酶、青霉素、鏈霉素、紅細胞裂解液、小鼠淋巴細胞分離液(TBD)、4％多聚甲醛、ELISA試劑盒(R&D)、real-timeRT-PCR試劑盒（Takara）、總RNA提取試劑盒(Takara)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）、磁珠抗體(Miltenyi)、流式抗體FITC anti-TCRγ/δ mAb、APC anti-CD3 mAb、PE/Cy7 an

5、ti-CD69 mAb及PE anti-IFN-γ/IL-4/IL-5/IL-13 mAb(BioLegend)。
　　2、病毒
　　用Hep-2細胞增殖人類呼吸道合胞病毒A2型(RSV A2)，采用30％蔗糖超速離心法分離病毒粒子，少量分裝，-80℃冰箱保存。RSV病毒滴度用組織細胞半數(shù)感染量(50％ Tissue culture infections dose，TCID50)表示。
　　二、試驗方法
　　1、

6、實驗動物模型
　　將購于北京華阜康生物科技股份有限公司的6-8周BALB/c鼠在本校實驗動物中心繁殖飼養(yǎng)。本實驗共設(shè)4組，組①:正常對照組（表示為:Mock）。對應(yīng)時間點給予相同劑量PBS;組②:成年期一次RSV感染組（表示為:Adult1°）。于出生后第8周用20μl含2×106 TCID50的RSV病毒懸液經(jīng)鼻感染小鼠;組③:成年期初次RSV感染，成年期再次感染組（表示為:Adult2°）。于出生后第4周用20μl含2×106

7、 TCID50的RSV病毒懸液經(jīng)鼻感染小鼠，第8周用20μl含2×106TCID50的RSV病毒懸液經(jīng)鼻再次感染小鼠;組④:新生期初次RSV感染，成年期再次感染組（表示為:Neonatal2°）。于出生后第1周用10μl含2×105 TCID50的RSV的病毒懸液經(jīng)鼻感染小鼠，第8周用20μl含2×106 TCID50的RSV的病毒懸液經(jīng)鼻再次感染小鼠。去除γδ T細胞實驗:新生期初次RSV感染鼠，于成年期再次RSV感染前1天及感染后第

8、2、3天，分別經(jīng)鼻粘膜給予10μg anti-TCRδ mAb[10，18]。
　　2、小鼠肺組織單細胞懸液制備
　　腹腔注射7.2％水合氯醛深度麻醉小鼠，經(jīng)心臟灌流20ml無菌PBS以去除血管內(nèi)血細胞后取肺組織。用10ml含有collagenase D(200μl10mg/ml)和DNaseⅠ(40μl10mg/ml)的10％ FBS RPMI-1640消化處理肺組織，淋巴細胞分離液分離肺組織淋巴細胞。
　　3、肺泡

9、灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluids，BALF)炎性細胞分類與計數(shù)
　　用含有1ml PBS的注射器經(jīng)支氣管沖洗肺組織，收集肺泡灌洗液。離心后收集上清，用于檢測細胞因子水平。100μl PBS重懸細胞沉淀，計數(shù)細胞總數(shù)并制備細胞涂片。Diff-Quick染色后顯微鏡下隨機選擇視野，計數(shù)200個細胞，依據(jù)形態(tài)學特點分別計數(shù)中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量。
　　4、肺組織病理標本制作及染色<

10、br>　　取模型鼠肺組織浸泡于4％多聚甲醛中固定48小時后，梯度乙醇逐級脫水，隨后經(jīng)過石蠟包埋、切片后進行HE染色，光學顯微鏡觀察模型鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)情況。
　　5、細胞因子mRNA水平的檢測
　　用RNAiso plus試劑盒提取肺組織總RNA，PrimeScript TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測肺組織局部Th

11、1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達水平。
　　6、細胞因子蛋白檢測
　　按照ELISA試劑盒說明，定量測定肺胞灌洗液中Th1型細胞因子γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)，Th2型細胞因子白細胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-5（Interleukin-5，IL-5）和白細胞介素-13（Interleukin-13，IL-13）的蛋

12、白含量。
　　7、流式細胞術(shù)檢測γδ T細胞
　　調(diào)整小鼠肺組織淋巴細胞濃度，加入FITC anti-TCRγ/δ mAb、APC anti-CD3mAb及PE/Cy7 anti-CD69 mAb(BioLegend)，避光，4℃孵育30分鐘。2％ FBS-PBS洗滌兩次，300μl2％ FBS-PBS重懸細胞，上機檢測。
　　8、流式細胞術(shù)檢測γδ T細胞內(nèi)細胞因子
　　細胞經(jīng)表面染色后，2％ FBS-PBS洗

13、滌一次;向細胞懸液中加入2μl/ml的CellActivation Cocktail(BioLegend)，37℃5％ CO2培養(yǎng)箱孵育1h后，加入2μM蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(Monensin)，繼續(xù)孵育4h。2％ FBS-PBS洗滌兩次，加入250μlFixation and Permeabilization Solution(BD)，避光，4℃孵育20分鐘。Perm/WashBuffer(BD)和2％ FBS-PBS洗滌后，加入PE標記的

14、細胞因子抗體(IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13)或同種型抗體，避光，4℃孵育30分鐘。2％ FBS-PBS洗滌兩次，300μl2％ FBS-PBS重懸細胞，上機檢測。
　　三、統(tǒng)計學分析
　　所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果以均值±標準差（X±S）表示。組間比較采用ANOVA進行統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、新生期初次RSV感染加

15、重成年期再次感染時的氣道炎癥
　　為了探究初次RSV感染時間對再次感染時氣道炎癥的影響，出生1周的新生鼠或4周的成年鼠經(jīng)鼻感染RSV，所有小鼠在第8周再次經(jīng)鼻感染RSV。HE染色發(fā)現(xiàn)與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺組織細支氣管周圍出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，肺泡灌洗液中炎性細胞總數(shù)明顯增加，其中以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞數(shù)量增加尤為顯著，提示新生期初次RSV感染加重成

16、年期再次感染時所誘發(fā)的氣道炎癥。
　　2、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺組織局部Th2型細胞因子水平
　　采用ELISA法定量檢測模型鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2型細胞因子的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺泡灌洗液中Th2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13明顯升高，而Th1型細胞因子IFN-γ水平?jīng)]有明顯改變。
　　利用Re

17、al-time RT-PCR技術(shù)檢測模型鼠肺組織Th1型細胞因子IFN-γ，Th2型細胞因子IL-4、IL-5及IL-13 mRNA表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺組織局部Th2型細胞因子IL-4、IL-5及IL-13 mRNA的表達顯著增加，而Th1型細胞因子IFN-γ水平明顯降低，推測新生期初次RSV感染通過影響Th2型細胞因子的水平左右成年期再次感染時的氣

18、道炎癥。
　　3、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺組織局部γδ T細胞及活化γδ T細胞數(shù)量
　　利用流式細胞術(shù)檢測模型鼠肺組織γδ T細胞總數(shù)及其活化的γδ T細胞（細胞表面標記為:CD69+γδ T）數(shù)量。結(jié)果顯示，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺組織局部γδ T細胞總數(shù)以及活化的γδ T細胞的百分比和細胞數(shù)均明顯增加。
　　4、新生期初次RSV感

19、染增加成年期再次感染鼠肺組織內(nèi)Th2型γδ T細胞數(shù)量
　　通過流式細胞術(shù)分析模型鼠肺組織局部分泌Th1/Th2型細胞因子的γδ T細胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，分泌Th2型細胞因子的γδ T細胞，如IL-4+γδT細胞、IL-5+γδ T細胞、IL-13+γδ T細胞數(shù)量明顯增加，然而分泌Th1型細胞因子的γδ T細胞，如IFN-γ+γδ T細胞數(shù)量卻

20、顯著降低，提示新生期RSV感染通過增加肺局部Th2型γδ T細胞數(shù)量影響再次RSV感染時所誘發(fā)的氣道炎癥。
　　5、新生期初次RSV感染通過影響γδ T細胞生物學功能左右成年期再次感染時所誘發(fā)的氣道炎癥
　　為進一步明確新生期初次RSV感染通過增加成年期再次感染鼠肺組織內(nèi)Th2型γδT細胞數(shù)量，進而加重氣道炎癥，我們利用新生期初次RSV感染鼠，于成年期再次感染的前1天，感染后第2天和第3天經(jīng)鼻粘膜給予anti-TCRδ mA

21、b以去除γδ T細胞。結(jié)果顯示，與對照組相比，anti-TCRδ mAb處理組小鼠肺組織細支氣管周圍炎性細胞浸潤明顯減輕，肺泡灌洗液中炎性細胞數(shù)量明顯降低，其中嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量降低尤為顯著，同時伴有Th2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平明顯降低，而Th1型細胞因子IFN-γ水平?jīng)]有明顯改變，提示新生期初次RSV感染通過影響肺組織局部γδ T細胞生物學活性和功能，調(diào)控成年期再次感染時所誘發(fā)的氣道炎癥。
　　結(jié)論