臍帶MSC來源exosome在皮膚組織再生中的作用及機制.pdf

1、目的：
　　燒燙傷是日常生活常見的一種創(chuàng)傷，具有高發(fā)病率和死亡率；有報道證實臍帶間質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC）加速損傷皮膚的創(chuàng)面愈合，然而MSC的保存、運輸及安全性等問題限制了其臨床應用；外泌體（exosome）是hucMSC旁分泌的主要成分，hucMSC-exosome（hucMSC-Ex）在皮膚組織再生中的作用尚未報道。本研究旨在探明hucMS

2、C-Ex促進深Ⅱ度燙傷的修復作用以及闡明exosome促進皮膚再生過程中信號轉(zhuǎn)導的機制。
　　方法：
　　貼壁法分離培養(yǎng)hucMSC細胞，蔗糖密度梯度離心法分離hucMSC-Ex，通過Western blot分析 hucMSC-Ex表面標記CD63、CD81和 CD9的表達，透射電鏡觀察hucMSC-Ex形態(tài)和大小，Nanosight可視型納米顆粒分析儀檢測hucMSC-Ex的直徑分布情況。80℃熱水燙傷8s制作SD大鼠皮膚

3、深Ⅱ度燙傷模型并應用hucMSC-Ex治療，通過創(chuàng)面大體、HE染色、PCNA和CK19的組織化學染色等方法分析其修復效果；Western blot檢測Bcl-2、Bax表達和流式細胞術Annexin V/PI雙染等技術分析細胞凋亡；細胞計數(shù)檢測細胞增殖；劃痕實驗分析細胞的遷移；流式細胞術PI染色分析細胞周期；通過PI3K的抑制劑LY294002證明AKT通路在hucMSC-Ex促進皮膚組織再生中的作用；通過β-catenin抑制劑ICG

4、001證明Wnt/β-catenin信號的作用；應用慢病毒載體介導的shRNA干擾hucMSC-Ex及hucMSC中的Wnt4驗證其在深度燙傷修復中作用。應用免疫組化和免疫熒光檢測皮膚組織中CK15、CK19、Integrinα6、CD44、Oct4及 Nanog的表達，以標記干細胞的數(shù)量；定量RT-PCR檢測皮膚組織中膠原I和膠原III的表達， Masson染色分析組織中膠原的沉積，皮膚組織和真皮細胞α-SMA的免疫熒光檢測真皮成纖維

5、細胞（DFL）向纖維母細胞的分化；免疫熒光和細胞核質(zhì)蛋白分離檢測分析β-catenin和YAP在細胞中定位；TopFlash檢測β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，YAP-TEAD4熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測YAP的轉(zhuǎn)錄活性；流式細胞術分析CD44在DFL細胞的表達情況；定量RT-PCR分析YAP的靶基因CTGF及Cy61的mRNA表達；免疫組化檢測p-YAP和YAP在皮膚組織中的表達和定位；將YAP的Ser127和LATS的Thr1079位點

6、突變?yōu)楸彼?，以證明此磷酸化位點的功能；液相質(zhì)譜分析（LC/MS）分析hucMSC-Ex內(nèi)14-3-3ζ等成分，shRNA敲減14-3-3ζ、α-catenin、YAP、LATS1/2等分子，腺病毒過表達14-3-3ζ和 YAP，以證明它們的功能；通過免疫共沉淀技術（IP）檢測14-3-3ζ、YAP、p-LATS等蛋白間相互作用。
　　結(jié)果：
　　成功分離得到hucMSC-Ex，電鏡觀察其形態(tài)為球形，Nanosight分析其

7、直徑為100nm左右，表達CD63、CD81和CD9等標記；成功建立SD大鼠皮膚深II度燙傷模型，hucMSC-Ex加快深II度燙傷皮膚創(chuàng)面愈合，促進皮膚組織細胞的增殖和表皮的再生化，同時促進皮膚組織膠原的合理分布；hucMSC-Ex逆轉(zhuǎn)熱激損傷引起的細胞凋亡，促進體外細胞擴增；對MAPK通路和AKT通路的篩檢發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex顯著地的活化AKT信號通路，Luminex檢測發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex中存在包括VEGF等多種可能活化AK

8、T信號的細胞因子；PI3K的抑制劑LY294002可以逆轉(zhuǎn)hucMSC-Ex對細胞凋亡的降低作用，但沒有改變hucMSC-Ex對皮膚細胞周期和細胞遷移的促進作用；進一步研究表明，hucMSC-Ex可以活化Wnt/β-catenin信號，并且β-catenin的抑制劑ICG001逆轉(zhuǎn)hucMSC-Ex對皮膚損傷的修復作用；將hucMSC-Ex中的Wnt4敲減后（Wnt4-shRNA-Ex），hucMSC-Ex促進皮膚細胞分裂、遷移和加速深

9、II度燙傷創(chuàng)面愈合的作用消失。對exosome治療深II度燙傷模型長期觀察可以發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex對皮膚細胞增殖和β-catenin活化呈現(xiàn)先促進后抑制的現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex在修復的后期限制皮膚干細胞的擴增、真皮細胞中α-SMA的表達和膠原III的沉積；體外研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex對細胞增殖和β-catenin入核的抑制作用依賴于高細胞密度培養(yǎng)條件，hucMSC-Ex抑制在此培養(yǎng)條件下生長的DFL中α-SMA表達和膠

10、原的沉積；進一步研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex通過促進YAP的磷酸化而誘導YAP的胞質(zhì)內(nèi)滯留，hucMSC-Ex對β-catenin抑制作用依賴于YAP Ser127位點的磷酸化；對hucMSC-Ex的液相質(zhì)譜分析（LC/MS）發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ，此蛋白在Hippo通路中有調(diào)控作用，hucMSC-Ex中敲減14-3-3ζ的表達逆轉(zhuǎn)了hucMSC-Ex對YAP Ser127位點磷酸化的促進作用和體外細胞增殖抑制作用，hucMSC-Ex中過表

11、達14-3-3ζ得到相反結(jié)果；將細胞中LATS干擾后或者將LATS Thr1079位點突變后，14-3-3ζ對YAP磷酸化的促進作用降低；14-3-3ζ、YAP、p-LATS三者可以形成復合物，YAP與其上游激酶p-LATS的結(jié)合依賴于14-3-3ζ蛋白；應用14-3-3ζ敲減的hucMSC-Ex（sh14-3-3ζ-Ex）治療深度燙傷模型發(fā)現(xiàn)，sh14-3-3ζ-Ex比對照exosome表現(xiàn)出更強的促增殖能力，修復后皮膚組織表皮層異常