肝細胞癌和膽囊癌基因表達譜分析及肝癌相關基因單核苷酸多態(tài)性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 肝癌相關AFP和HNF1A基因單核苷酸多態(tài)性研究
　　單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因組水平上的DNA多態(tài)性，可發(fā)生在基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究在課題組前期原發(fā)性肝癌易感性基因系列研究基礎上，重點聚焦AFP和HNF1A基因非編碼區(qū)SNP位點多態(tài)性的研究，尋找這些位點與HCC易感性之間的關聯(lián)，以及它們對基因轉錄的調控機制。我們通過聚合酶鏈反應-連接酶方法

2、(Polymerase chain reaction-Ligation detection reaction，PCR-LDR)對來自中國漢族人群的1058例樣本進行了SNP位點基因型檢測。檢測的SNP位點包括:AFP基因SNP位點rs6834059、rs4018和rs4024，以及HNF1A基因SNP位點rs73539。通過病例對照研究，評估了這些位點與HBV感染以及HBV相關HCC之間的關聯(lián)性。然后，我們通過構建rs4024和rs73

3、5396位點野生型和突變型的熒光報告載體，初步研究了它們對基因轉錄活性的影響。我們通過體外EMSA實驗進一步驗證了它們對基因轉錄活性的影響。結果顯示AFP的SNP位點rs6834059和rs4024基因多態(tài)性分別與HCC患者是否伴有肝硬化和TNM分期存在統(tǒng)計學相關。rs6834059位點G/G基因型在伴有肝硬化的HCC患者中比例更高(P=0.038，OR=2.72，95％CI:1.02-7.26)，而rs4024位點G/G基因型在高TN

4、M分期的HCC患者中比例更高(P=0.031，OR=1.88，95％CI:1.05-3.37)。此外，rs735396位點多態(tài)性與HBV相關HCC易感性之間存在顯著相關性，攜帶A/A基因型人群具有更高的HCC患病風險(P=0.024，OR=1.55，95％CI:1.06-2.26)。熒光報告基因檢測結果顯示rs4204位點G/G基因型和rs735396位點G/G基因型具有更高的轉錄活性。此外，EMSA實驗結果顯示rs4204位點G/G與

5、A/A基因型之間結合所在調控序列的核蛋白能力存在差異。結論:通過病例對照研究，我們發(fā)現(xiàn)了AFP基因SNP位點rs735396多態(tài)性與HCC的易感性顯著相關，而AFP基因SNP位點rs6834059和rs4024多態(tài)性與HCC的進展顯著相關。進一步功能學研究揭示了rs735396和rs4204位點多態(tài)性在基因轉錄中的調控作用。
　　第二部分 肝細胞癌與肝硬化基因表達譜差異分析
　　肝硬化(Cirrhosis)是肝細胞癌(HCC

6、)高危風險因素，易進展為HCC并最終導致死亡。本研究旨在比較HCC和Cirrhosis組織之間的基因表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)從Cirrhosis演變?yōu)镠CC過程中的關鍵基因(Hub genes)，以及這些基因在疾病過程中的作用。我們從高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(Gene expression Omnibus，GEO)下載了4個HCC和Cirrhosis相關數(shù)據(jù)集，并將HCC組織樣本和正常肝組織樣本數(shù)據(jù)合并為HCC數(shù)據(jù)集，將Cirrhosis組織樣本數(shù)據(jù)

7、定義為C數(shù)據(jù)集合。然后，我們使用WGCNA軟件包構建了HCC和C數(shù)據(jù)集的權重基因共表達網(wǎng)絡，獲得顯著共表達的基因模塊，并通過flashClust和dynamicTreeCut軟件包對得到的基因模塊進行了分析，根據(jù)連接度計算篩選到出Hub基因。最后，應用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對模塊特異性基因以及Yellow模塊中Hub基因進行功能注釋，并通過Cytoscape軟件可視化顯示功能注釋網(wǎng)絡。結果顯示在排除了離群樣本后，HCC數(shù)據(jù)集包含有394個

8、HCC組織樣本和29正常肝組織樣本數(shù)據(jù)，C數(shù)據(jù)集包含215個肝硬化組織樣本數(shù)據(jù)。HCC數(shù)據(jù)集構建了6個基因模塊，分別標記為:藍、棕、青綠、綠色、紅色和黃色。其中的藍、棕、青綠在HCC和C數(shù)據(jù)集之間具有高保守性，而黃色保守性最低。這些模塊中的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與轉錄、有絲分裂、陽離子運輸、陽離子穩(wěn)態(tài)以及環(huán)化酶的分泌和調控有關。黃色基因模塊中包含有編碼細胞因子的基因，例如:CCL22和IL19，這些細胞因子可在HCC的發(fā)生過程中起到重要的作用。

9、結論:通過HCC與Cirrhosis組織基因表達譜的WGCNA比較分析，發(fā)現(xiàn)了6個顯著共表達的基因模塊，其中一個基因模塊可能與肝硬化進展為HCC緊密相關。通過Hub基因分析，我們發(fā)現(xiàn)了一些在肝硬化和肝細胞癌之間差異表達的基因，它們可能是HCC進展過程中發(fā)揮作用的重要因子。對這些基因進一步的功能研究，將有助于我們更好地了解HCC發(fā)病的分子機制。
　　第三部分 基于RNA-Seq的膽囊癌轉錄組研究
　　膽囊癌是一種相對少見的的惡

10、性腫瘤，具有高惡性程度、易早期轉移、難于早期發(fā)現(xiàn)、對化療藥物不敏感等特點。本研究旨在通過對癌組織(TT)與癌旁組織(ANTT)之間差異表達基因(DEGs)的研究，發(fā)掘差異表達基因對膽囊癌形成和發(fā)展的影響機制，為尋找新的診治靶點提供實驗依據(jù)。首先，我們從本實驗室前期研究的轉錄組測序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)中挑選了16個DEGs。然后，通過實時熒光定量PCR技術(Real-time PCR)，在一個包含35例膽囊癌患者的獨立樣本中，對這些DE

11、Gs進行了驗證。而且，我們結合臨床隨訪信息，在差異表達基因與臨床數(shù)據(jù)之間進行了關聯(lián)性分析。結果顯示其中有12個差異表達基因在驗證組的表達數(shù)據(jù)與RNA-Seq數(shù)據(jù)一致。BIRC5、TK1、TNNT1和MMP9基因表達水平與膽囊癌手術后預后相關。BIRC5基因表達與TNM(tumor-node-metastasis)分期之間存在顯著相關性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)血清CA19-9檢測值與TNNT1、MMP9和CLIC3基因表達水平之間有統(tǒng)計學相關性