金雀異黃素納米緩釋-人工晶狀體載藥系統(tǒng)的構建及其抑制后發(fā)性白內障的研究.pdf

1、目的：
　　本課題我們選擇了金雀異黃素作為抑制后發(fā)性白內障的藥物、將其制備成納米脂質載體的緩釋劑型、通過傳統(tǒng)的浸泡吸附法和創(chuàng)新的化學鍵合法將其加載到IOL上植入晶狀體囊袋內作為給藥途徑，構建金雀異黃素納米緩釋-人工晶狀體給藥系統(tǒng)，全面檢測該系統(tǒng)在體外和眼內的藥物釋放特性，其對晶狀體上皮細胞增殖、移行、間充質化的抑制情況，評價其對延緩控制兔眼內后發(fā)性白內障形成的有效性和對眼內周圍組織安全性的效果，為其日后應用于臨床防治后發(fā)性白內障的

2、發(fā)生提供實驗基礎。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04）由遼寧省晶狀體學重點實驗室提供;新西蘭大耳白兔由中國醫(yī)科大學動物部提供;人工晶狀體購于相關品牌代理商。
　　二、實驗方法和檢測指標
　　1、CCK-8法檢測金雀異黃素納米脂質載體(Gen-NLC)對細胞活力的影響并確定細胞實驗使用的藥物濃度。
　　2、細胞劃痕實驗檢測金雀異黃素納米脂質載體對轉化生長因子-β(T

3、GF-β)誘導的細胞移行能力的影響。
　　3、實時定量聚合酶鏈反應(real time qPCR)、免疫印跡法(western blot)和免疫熒光法(immunofluorescence assay)檢測金雀異黃素納米脂質載體對TGF-β誘導的上皮細胞間充質轉化的影響。
　　4、乳化超聲法制備殼聚糖鹽酸鹽修飾的金雀異黃素納米脂質載體(Gen-NLC-CHC)和脫氧膽酸鈉修飾的金雀異黃素納米脂質載體(Gen-NLC-SDC)

4、，并采用透射電鏡觀察其形態(tài)、采用激光納米粒度電位儀分別測定粒徑大小、分散指數、Zeta電位。
　　5、葡聚糖凝膠微柱法測定Gen-NLC-CHC和Gen-NLC-SDC的包封率。
　　6、差示掃描熱分析法(DSC)測定Gen-NLC-CHC和Gen-NLC-SDC凍干粉末的DSC圖譜。
　　7、采用透析技術檢測Gen-NLC-CHC和Gen-NLC-SDC的體外藥物溶出釋放度。
　　8、采用靜電力顯微鏡測量人工晶

5、狀體表面帶電性質和帶電量。
　　9、浸泡吸附法、化學鍵合法制備金雀異黃素納米脂質緩釋-人工晶體載藥系統(tǒng)(Gen-NLC-IOL)并采用掃描電鏡觀察人工晶狀體上的藥物形態(tài)。
　　10、采用透析法檢測不同人工晶狀體和不同納米脂質載體通過不同方法構建的Gen-NLC-IOL的體外藥物釋放度并比較不同組合的載藥量差異。
　　11、新西蘭白兔右眼行常規(guī)晶狀體超聲乳化吸除術建立動物后發(fā)性白內障模型，術中分別植入普通IOL，植入普通

6、IOL聯(lián)合前房等量Gen-NLC注藥及植入Gen-NLC-IOL載藥系統(tǒng)。
　　12、采用透析技術檢測動物前房水中藥物釋放度，比較Gen-NLC-IOL組和前房注藥組藥物濃度變化的差異。
　　13、采用眼科裂隙燈顯微鏡連續(xù)觀察兔眼術后后囊膜變化，并比較對照組、前房注藥組和Gen-NLC-IOL組后囊膜混濁變化情況。
　　14、蘇木素-伊紅染色法光鏡下檢測不同組后囊膜細胞增殖移行的情況。
　　15、免疫組化SP法檢

7、測不同組后囊膜的增殖細胞核抗原(PCNA)的表達量變化。
　　16、石蠟包埋固定切片蘇木素-伊紅染色染色光鏡下檢測角膜內皮和視網膜結構形態(tài)的情況。
　　17、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色法透射電鏡下觀察角膜內皮細胞和視網膜各層超微結構形態(tài)學改變。
　　結果：
　　一、金雀異黃素納米脂質載體(Gen-NLC)對細胞增殖的影響
　　CCK-8實驗檢測加入不同濃度的納米脂質載體(NLC)后，細胞活力未見明顯下降，即

8、NLC未對細胞有明顯的抑制效果，即使加入高濃度NLC(75mg/L)時，細胞活力仍在90％以上。
　　二、金雀異黃素納米脂質載體(Gen-NLC)對細胞移行的影響
　　細胞劃痕實驗通過測量細胞劃痕的閉合情況來檢測細胞遷移能力的變化。在加入轉化生長因子-β(TGF-β)后，細胞移行能力增加，劃痕恢復能力強，閉合程度高，在加入低濃度和高濃度的Gen-NLC后各組劃痕的閉合程度降低，其中高濃度實驗組對細胞移行抑制更加明顯，低濃度和

9、高濃度實驗組細胞劃痕寬度恢復百分率與TGF-β組相比，均差異有統(tǒng)計學意(P＜0.001)。
　　三、金雀異黃素納米脂質載體(Gen-NLC)對上皮細胞間充質化的影響
　　α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是評價上皮細胞間充質化的重要指標之一，利用real time qPCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TGF-β組α-SMA的mRNA水平明顯升高，加入不同濃度Gen-NLC之后，α-SMA的mRNA水平均降低，高濃度和低濃度實驗

10、組與TGF-β組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　四、帶電金雀異黃素納米脂質載體特性的檢測結果
　　Gen-NLC-SDC/CHC納米粒直徑比Gen-NLC略增加，但是均保持在100nm左右，加入殼聚糖鹽酸鹽的納米粒帶有正電，而加入脫氧膽酸鈉的納米粒帶負電，所有的納米粒的包封率均在90％以上。
　　五、不同人工晶狀體表面電性和帶電荷量
　　聚甲基丙烯酸甲酯人工晶狀體:(RS-55B，AAREN)帶電量為0

11、.91×106/cm2。疏水性丙烯酸酯人工晶狀體:(EC-3Y，AAREN)帶正電為2.0×106/cm2;(HOYA，YA-60BB)帶電量為-2.4×106/cm2。親水性丙烯酸酯人工晶狀體:(570C，Rayner)帶正電為0.05×106/cm2;(Akreos Adapt，Baush&Lomb)帶負電為-0.072×106/cm2。硅凝膠人工晶狀體(KS-3Ai，CANON)帶負電為-0.0063×106/cm2。
　　

12、六、金雀異黃素納米緩釋-人工晶狀體載藥系統(tǒng)(Gen-NLC-IOL)的構建及優(yōu)化
　　（一）人工晶狀體的材質對載藥量的影響
　　通過浸泡吸附法載藥顯示:親水性丙烯酸酯IOL載藥量最高，其次是疏水性丙烯酸酯IOL，而聚甲基丙烯酸甲酯IOL和硅凝膠IOL最少，除了PMMA和硅凝膠IOL，不同材質IOL載藥量有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。
　?。ǘ┘{米脂質載體的電性電量對載藥量的影響
　　當IOL與NLC電性相反時

13、（即帶正電的IOL與帶負電的Gen-NLC，或者帶負電IOL與帶正電Gen-NLC結合），平均載藥量為14.65±1.64μg，當IOL與Gen-NLC電性相同時（即帶正電的IOL與帶正電的Gen-NLC或帶負電的IOL與帶負電的Gen-NLC結合）平均載藥量為11.16±1.20μg，兩者相比，當電性相反時載藥量明顯比相同時多，有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，說明IOL表面電荷性質與藥物納米粒之間的靜電吸附力可影響浸泡吸附法載藥量。<

14、br>　　（三）鍵合法和浸泡吸附法對載藥量的影響
　　化學鍵合法最大的載藥結合方式是親水性丙烯酸酯IOL與-20mv的Gen-NLC結合。浸泡法最大載藥量的方式的親水性丙烯酸酯IOL與其電性相反的I20ImvNLC結合。
　　七、不同給藥途徑前房水藥物濃度的比較
　　前房注藥組和Gen-NLC-IOL組的藥物濃度均在手術后6小時內達到峰值，隨時間延長濃度逐漸下降;Gen-NLC-IOL組的藥物濃度在任何時間點均顯著高于

15、前房注藥組，兩組藥物濃度在6h、12h、24h、48h和72h時間點均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001)。
　　八、不同給藥途徑對后囊膜情況的觀察和比較
　　體內動物實驗:術后連續(xù)12周觀察后囊膜變化。在術后2周時，對照組可見后囊膜周邊區(qū)輕度混濁，而前房注藥組和實驗組后囊膜均保持透明;在術后4周時，對照組后囊膜混濁加重，可見上皮細胞增殖、移行，皮質增生，前房注藥組可見后囊膜輕度混濁，囊膜皺縮，而實驗組后囊膜保持透明;在12周時，

16、對照組后囊膜周邊區(qū)和中央區(qū)全部混濁，前房注藥組可見周邊囊膜片狀致密纖維化混濁，并累及后囊膜中央區(qū)，而實驗組可見周邊后囊膜輕度混濁，中央區(qū)透明。
　　體外細胞實驗:術后4周處死動物后觀察后囊膜晶狀體上皮細胞增殖情況可見對照組晶狀體上皮細胞增殖移行數量最多，且在周邊和中央區(qū)區(qū)均有分布;前房注藥組可見中央區(qū)少量細胞增殖移行;實驗組晶狀體后囊膜中央區(qū)未見明顯細胞增殖移行。
　　九、眼內其他組織形態(tài)學的評價
　　光鏡下可見各組角

17、膜內皮細胞連續(xù)平順，未見明顯缺失;視網膜10層結構完整，未見明顯的細胞形態(tài)學改變。
　　結論：
　　1、金雀異黃素納米臘質載體(Gen-NLC)可以有效的抑制人晶狀體上皮細胞的增殖、遷移和間充質轉化。
　　2、金雀異黃素納米脂質載體可以緩慢可控釋放藥物，納米脂質載體是一種有效的緩釋給藥劑型。
　　3、通過浸泡吸附法載藥時人工晶狀體的材質可以影響載藥量，其中親水性丙烯酸酯人工晶狀體載藥量最大。
　　4、通過浸