乙腦減毒活疫苗關鍵功能位點分析及相關病毒載體應用研究.pdf

1、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），簡稱乙腦病毒，是乙型腦炎（簡稱乙腦）的病原體，主要流行在東南亞和太平洋地區(qū)，在全球范圍內每年引起約68，000例乙腦病例，死亡約10，000例。乙腦病毒主要以三帶喙庫蚊為媒介在脊椎動物宿主之間傳播。病毒感染嚴重危害中樞神經系統(tǒng)，約有50％的幸存者患有伴隨終生的神經系統(tǒng)后遺癥。近年來，乙腦病毒引起的感染范圍正在擴大。乙腦已成為世界上最嚴重的病毒性腦炎類疾病之一

2、，嚴重威脅人類健康。
　　疫苗接種是預防乙腦的有效手段。乙腦減毒活疫苗SA14-14-2于1989年在中國被批準上市，已有超過3億兒童接種了該減毒活疫苗。研究顯示，該疫苗株具有良好的減毒特性與安全性，生產成本低，單次免疫即能有效誘導產生保護性中和抗體，而且免疫力持久。2013年，該疫苗株通過了世界衛(wèi)生組織疫苗生產預認證，被推薦在世界范圍內使用。但目前對乙腦活疫苗的減毒機制尚不完全清楚。
　　乙腦病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，是有

3、包膜的單股正鏈RNA病毒。其基因組編碼3種結構蛋白[衣殼蛋白(C)、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）和包膜糖蛋白(E)]和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。結構蛋白主要參與病毒吸附、侵入和組裝，非結構蛋白主要負責病毒基因組的復制。研究表明，黃病毒的非結構蛋白NS1能夠以細胞表面、細胞內以及細胞外分泌等多種形式表達，與病毒的復制、組裝以及宿主的免疫應答調節(jié)密切相關。相關研究還發(fā)現，乙腦血清亞

4、組各成員在感染過程中還表達一種NS1相關蛋白NS1'，生物信息學分析顯示該蛋白是位于NS2A基因上程序性-1核糖體移碼的產物。目前，該血清亞組特有的NS1'蛋白在乙腦病毒致病過程中的表達及功能尚未明確。
　　另一方面，近年來乙腦病毒的流行范圍和分布區(qū)域發(fā)生了較大的改變。基因Ⅰ型病毒已經逐漸取代原有的基因Ⅲ型病毒成為當下主要的流行株，而現有的所有乙腦疫苗都來源于基因Ⅲ型病毒。有研究顯示，來源于Ⅲ型的滅活疫苗誘導宿主產生針對其他基因型

5、病毒株的中和抗體能力明顯降低。乙腦減毒活疫苗對目前的Ⅰ型病毒流行株的保護作用是否受到影響尚有待研究，發(fā)現并確認影響乙腦疫苗株保護效力關鍵的中和位點對乙腦的防控和治療具有重要的意義。
　　此外，乙腦疫苗株高度減毒，具有良好的安全性及免疫原性，因此有望發(fā)展為新的病毒類表達載體。
　　針對上述科學問題，本研究首先對決定NS1'蛋白表達的關鍵因素以及NS1'蛋白在乙腦病毒致病過程中發(fā)揮的作用進行了探討，進一步發(fā)現并確認了影響乙腦疫苗

6、株誘導中和抗體效價的基因型特異中和位點，最后對該疫苗株表達外源基因的可行性和特性進行了評估。
　　本研究主要包括三個部分:
　　一、乙腦病毒非結構蛋白中的毒力位點鑒定與分析
　　為尋找決定NS1'蛋白表達的關鍵因素及其對病毒毒力的影響，本研究將野生型乙腦病毒SA14與減毒疫苗株SA14-14-2感染BHK-21與C6/36細胞，通過Western blot檢測感染細胞中NS1與NS1'蛋白的表達。結果表明，SA14能夠

7、在感染細胞中同時表達2種形式的NS1蛋白，而在SA14-14-2感染細胞中僅能檢測到NS1蛋白的表達。
　　通過核苷酸序列比對發(fā)現，與JEV血清亞組的病毒分離株相比，在疫苗株SA14-14-2 NS2A基因第66位核苷酸存在一個沉默突變(G→A)，稱為G66A。對乙腦病毒基因組相應區(qū)域進行RNA結構預測發(fā)現，G66A核苷酸突變影響了位于NS2A基因上的假結結構穩(wěn)定性，而該假結結構是NS1'蛋白形成的必要條件。
　　為證實該沉

8、默突變對NS1'蛋白表達及病毒毒力的影響，我們在乙腦病毒SA14全長感染性克隆的基礎上引入G66A核苷酸突變，拯救獲得攜帶該突變的恢復病毒(G66A)。評價SA14與突變病毒G66A感染細胞中NS1相關蛋白的表達發(fā)現，與SA14相比，G66A喪失了NS1'蛋白的表達能力而只能表達NS1。隨后，通過比較SA14與G66A突變病毒在小鼠模型上的致病性發(fā)現，突變病毒G66A的神經毒力與神經侵襲力均明顯弱于SA14，且在鼠腦中的增殖能力也低于S

9、A14。
　　上述研究結果表明，乙腦病毒NS2A的第66位核苷酸突變G66A影響了假結結構依賴的移碼，進而抑制了NS1'蛋白的表達，是乙腦病毒的一個新的關鍵毒力位點。
　　二、乙腦病毒基因型特異中和位點的鑒定與分析
　　為了分析乙腦疫苗株對不同基因型病毒株的保護效力，本研究首先評價了16份減毒活疫苗免疫人血清樣品對疫苗株SA14-14-2以及乙腦病毒分離株FJ03、 SX06、SC04和SH53的中和效價。結果表明，免

10、疫血清對乙腦病毒分離株的中和效價要顯著低于疫苗株。
　　為進一步分析影響中和抗體效價的關鍵因素，本研究對基因Ⅰ型和基因Ⅲ型乙腦病毒的E蛋白氨基酸序列進行了比對，發(fā)現第222和327位氨基酸是基因型特異的氨基酸位點。進一步利用反向遺傳學技術將A222S與S327T氨基酸突變引入到基因Ⅲ型乙腦病毒感染性克隆中，拯救攜帶相應氨基酸突變的恢復病毒（A222S、S327T和A222S/S327T）。突變病毒的蛋白表達效率、蝕斑形態(tài)、體外增殖

11、特性和病毒毒力與野生型病毒相比無明顯差異，而蝕斑減少中和試驗結果表明，乙腦疫苗SA14-14-2免疫血清對突變病毒的中和效價與野生型病毒相比有所降低，該結果表明A222S與S327T突變可能影響了減毒活疫苗免疫誘導的中和抗體效力。
　　本研究進一步將相應的氨基酸突變引入到乙腦減毒活疫苗中，并評價了突變疫苗株對基因Ⅰ型病毒分離株SX06和SH53的保護效力。結果顯示，攜帶A222S與S327T氨基酸單點突變的疫苗株免疫小鼠誘導的中和

12、抗體效價與原疫苗株相比較高，且突變疫苗株保持了較好的遺傳穩(wěn)定性與減毒特性，表明E蛋白中基因型特異氨基酸位點可能是乙腦病毒潛在的重要中和位點，將A222S與S327T氨基酸突變引入減毒活疫苗基因組中有助于提高其對基因Ⅰ型病毒流行株的保護效力。
　　三、基于乙腦減毒株的病毒表達系統(tǒng)的建立與應用
　　本研究以乙腦減毒株感染性克隆為基礎，通過反向遺傳學技術，將基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的結構基因E

13、3-E2 DomainA片段與腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點序列引入乙腦病毒基因組C基因下游，并在CHIKV基因編碼區(qū)末端添加終止密碼子，構建了攜帶CHIKV抗原基因的重組病毒感染性克隆。體外轉錄制備的相應RNA轉染細胞后能夠導致典型的細胞病變效應，RT-PCR結果顯示外源基因被成功插入到乙腦病毒基因組中。重組病毒在BHK-21細胞上形成的蝕斑明顯小于乙腦減毒株，且在細胞上的增殖能力有所降低。間接免疫熒光實驗證實重組病毒能夠有效表達C

14、HIKV外源蛋白。上述結果表明，本研究成功構建了攜帶CHIKV抗原基因的重組乙腦病毒，并證實了乙腦減毒株作為病毒載體的可行性，該表達系統(tǒng)為新型重組病毒類疫苗的設計和研發(fā)奠定了基礎。
　　綜上，本研究以乙腦病毒感染性克隆為基礎，將生物信息學技術與反向遺傳學突變分析相結合，證實了乙腦減毒活疫苗SA14-14-2非結構蛋白NS2A中的G66A核苷酸突變破壞了假結結構依賴的核糖體移碼，從而抑制了NS1'蛋白的表達，最終降低了病毒的神經毒力