Calpastatin-Calpain系統(tǒng)通過MMP2-TGF-β1通路改善血管再狹窄.pdf

1、目的：以過表達鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的小鼠及血管平滑肌細胞(vascular smooth mucle cells，VSMCs)為研究對象，評估鈣蛋白酶抑制蛋白/鈣蛋白酶（Calpastatin/Calpain）系統(tǒng)在平滑肌細胞增殖、遷移、膠原合成及血管再狹窄中的作用，旨在探討Calpastatin/Calpain系統(tǒng)在辛伐他汀(simvastatin)改善PDGF誘導的血管再狹窄過程中的作用。
　　方法：⑴動

2、物實驗：分組:C57BL/6J野生小鼠假手術組(WT mice)、C57BL/6J野生小鼠模型組(WT ligation mice)、Calpastatin轉基因小鼠假手術組(TG mice)、Calpastatin轉基因小鼠模型組(TG ligation mice)；采用結扎頸動脈分叉處的方法造模；通過HE染色的方法檢測造模后0天、7天、14天、21天、28天勁動脈的內膜增生及血管狹窄程度；采用qRT-PCR的方法檢測勁動脈Calpa

3、in-1，Calpain-2，CalpastatinmRNA的表達情況；模后14天，采用免疫組織化學的方法檢測增殖細胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA)、Ⅰ型膠原纖維(CollagenⅠ)、Calpain-1、Calpain-2、Calpastatin、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、膜型基質金屬蛋白酶1(MT1MMP)、基質金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP2)在增生血管中的分布及表達。⑵細胞

4、實驗：分組:野生小鼠平滑肌細胞組(WT)、野生小鼠平滑肌細胞+PDGF-BB組(WT+PDGF-BB)、野生小鼠平滑肌細胞+PDGF-BB+辛伐他汀組(WT+PDGF-BB+Simvastatin)、轉基因小鼠平滑肌細胞組(TG)、轉基因小鼠平滑肌細胞+PDGF-BB組(TG+PDGF-BB)、轉基因小鼠平滑肌細胞+PDGF-BB+辛伐他汀組(TG+PDGF-BB+Simvastatin)；用CCK8試劑盒檢測各組干預條件干預后血管平滑

5、肌細胞的增殖能力；分別應用Transewell及細胞劃痕實驗檢測各組干預條件干預后血管平滑肌細胞的定向與非定向遷移能力；采用qRT-PCR的方法檢測各組干預條件干預后血管平滑肌細胞的Calpain-1,Calpain-2,Calpastatin,MMP2,MT1MMP, TIMP2,CollagenⅠ,TGF-β1mRNA的表達情況；用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測各組干預條件干預后血管平滑肌細胞相關蛋白(Cal

6、pain-1，Calpain-2，Calpastatin，MMP2，MT1MMP,TIMP2，TGF-β1)的表達，通過檢測SBDP(Spectrin breakdown products)的表達來檢測Calpain的活性。
　　結果：①血管再狹窄后Calpain-1，Calpain-2的mRNA表達增加，Calpastatin的mRNA表達減少。②造模14天后，與假手術組相比，Calpain-1，Calpain-2，TGF-β1

7、的mRNA表達增多，而轉基因小鼠組較野生小鼠組Calpain-1，TGF-β1的mRNA表達下降，Calpain-2的表達變化無統(tǒng)計學差異，且轉基因小鼠組較野生小鼠組PCNA陽性率減低， CollagenⅠ，Calpain-1，Calpain-2，Calpastatin，MMP2，MT1MMP/TIMP2的蛋白表達減少。③野生小鼠平滑肌+PDGF-BB組較野生小鼠平滑肌細胞組細胞增殖、遷移增加，且CollagenⅠ，CollagenⅢ，

8、Calpain-1的mRNA表達增多，Calpain-1，Calpain-2，MMP2，MT1MMP, TGF-β1的蛋白表達增多，Calpain的活性增加，而Calpastatin的蛋白表達減少。轉基因小鼠平滑肌細胞+PDGF-BB組(TG+PDGF-BB)較野生小鼠平滑肌+PDGF-BB組(WT+PDGF-BB)相應的都表達減少，Calpastatin的蛋白表達增加。④野生小鼠平滑肌+PDGF-BB+辛伐他汀組(WT+PDGF-BB

9、+Simvastatin)較野生小鼠平滑肌+PDGF-BB組(WT+PDGF-BB) Calpastatin的mRNA表達增加，而Calpain-1，MMP2，TGF-β1，CollagenⅠ，CollagenⅢ的mRNA表達減少，細胞增殖、遷移也減輕。轉基因小鼠平滑肌細胞+PDGF-BB+辛伐他汀組(TG+PDGF-BB+Simvastatin)較野生小鼠平滑肌+PDGF-BB+辛伐他汀組（WT+PDGF-BB+Simvastatin

10、)Calpain-1,MMP2,CollagenⅠ的mRNA表達及細胞增殖、遷移也減輕。
　　結論：⑴血管再狹窄的病理過程中，Calpain-1，Calpain-2表達增加，而Calpastatin表達減少。⑵過表達Calpastatin可以使血管再狹窄減輕。⑶Calpastatin/Calpain系統(tǒng)通過MT1MMP/TIMP2的比例來調節(jié)MMP2及其下游分子TGF-β1。⑷過表達Calpastatin通過調節(jié)Calpain-1