Kindlin-2通過促進TGF-β-Smad信號通路加速腎臟纖維化.pdf

1、研究背景
　　 慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)已成為威脅全世界公共健康的主要疾病之一,嚴重危害人類健康及經濟。流行病學調查數(shù)據(jù)顯示,慢性腎臟病在中國、美國、日本、加拿大及伊朗的發(fā)病率已達到10％-13％,不亞于糖尿病和高血壓的發(fā)病率。此外,CKD發(fā)病還呈現(xiàn)出年輕化趨勢,二三十歲的透析患者越來越多,年齡最小的甚至不到10歲,令人震驚。因此,延緩腎臟疾病并減少腎臟損傷已刻不容緩。
　　 腎

2、臟纖維化是各種進展性腎病的最終通路。盡管腎臟纖維化的發(fā)病機制復雜,但大量研究證實TGF-β在腎臟纖維化中發(fā)揮著關鍵性的作用,與細胞的增殖、凋亡、活化、遷移、細胞外基質合成有密切關系,參與腎纖維化的各個環(huán)節(jié)中,TGF-β被認為是最重要最強烈的纖維化誘導因子。TGF-β1誘導的生物學功能主要依賴其完整的Smads信號通路。TGF-β1首先與其Ⅱ型受體(TβRⅡ)結合,TβRⅡ磷酸化Ⅰ型受體(TβRⅠ),激活的TβRⅠ將活化Smad蛋白Sma

3、d2和Smad3,磷酸化的Smad2和Smad3隨后與Smad4一同進入細胞核,在核內調控了TGF-β1靶基因的轉錄。雖然大家都熟知這個過程,但是TGF-β1受體與Smad2和Smad3相互作用的機制還有待深入探索,研究發(fā)現(xiàn)在這過程中有多種銜接蛋白分子對其進行著調控從而促進TGF-β1-Smad信號。
　　 腎臟纖維化的病理特征是過量的細胞外基質(ECM)的積聚和沉積,而肌成纖維細胞(MFB)是導致病理條件下腎間質中ECM過度沉

4、積的主要效應細胞。研究證實上皮-間充質轉化((epithelial-mesenchymal transition,EMT)是MFB來源的一個重要機制。EMT,是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下失去其上皮表型向間充質細胞轉分化的現(xiàn)象。已有越來越多的研究強有力地證實了EMT在不同類型的腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用,而逆轉EMT則能有效改善腎臟纖維化。雖然大量研究揭示了各種EMT的始動因素、調節(jié)因子及存在的信號通路,但是在所有的因素中,TGF-

5、β1是核心因子,啟動并調節(jié)EMT的全過程。
　　 我們的課題合作研究組發(fā)現(xiàn)Kindlin-2蛋白可以誘導乳腺癌細胞EMT而促進乳腺腫瘤細胞的轉移。這個發(fā)現(xiàn)引起了我們對Kindlin-2分子的關注,Kindlin-2是否也參與腎臟上皮細胞的EMT而促進腎臟纖維化呢?Kindlin-2是Kindlin蛋自家族的一種,Kindlin蛋白家族是一類新型的銜接蛋白,它能與整合素相互作用加強整合素的激活。研究還發(fā)現(xiàn)Kindlin-2在肌動蛋

6、白極化、細胞伸展及整合素連接激酶定位在黏著斑中發(fā)揮著必不可少的作用。另外,Kindlin-2在胚胎發(fā)育及腫瘤進展中發(fā)揮著重要功能。
　　 目前,有關Kindlin-2在腎臟中的作用鮮有報道。唯一的一篇也是最新的一篇文獻指出Kindlin-2通過與整合素的相互作用調節(jié)足細胞的粘附和纖維連接蛋白的沉積,文中還提出TGF-β能明顯增加足細胞Kindlin-2的表達,提示Kindlin-2可能參與腎臟疾病。我們分別以人近端腎小管上皮細胞

7、為體外模型,以小鼠單側輸尿管結扎模型開展動物實驗并結合患有腎臟纖維化的臨床病人的腎臟活檢標本研究Kindlin-2在腎臟纖維化中的作用,并探討了Kindlin-2與TGF-β-Smad3信號通路的關系,闡明了具有創(chuàng)新性的分子機制。
　　 第一章 Kindlin-2參與TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞的上皮-間充質轉化(EMT)
　　 目的
　　 觀察Kindlin-2對HKC細胞上皮-間充質轉化的作用；研究TG

8、F-β1對Kindlin-2的調節(jié)作用并探索Kindlin-2在TGF-β1誘導HKC細胞EMT中充當?shù)慕巧?br>　　 方法
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)腎小管上皮細胞HKC,不同劑量的TGF—β1(0、1、2、5及10ng/ml)作用于HKC細胞48小時或5ng/ml TGF—β1作用于HKC細胞不同時間(0、12、24、48及72小時),或5 ng/ml TGF-β1處理HKC細胞不同時間(0、12、24及48小時),Weste

9、rn blot及Real-Time PCR檢測E-cadherin、α-SMA及FN蛋白和mRNA的表達。
　　 2.在HKC細胞中瞬時轉染全長Kindlin-2質粒和對照Flag載體48小時,Westernblot及Real-Time PCR檢測E-cadherin、α-SMA及FN蛋白和mRNA的表達。
　　 3.建立穩(wěn)定表達Kindlin-2和對照空載Flag的HKC細胞系,Western blot、Real-Ti

10、me PCR及免疫熒光檢測兩組細胞E-cadherin、α-SMA及FN的蛋白和mRNA表達。
　　 4.Kindlin-2 siRNA或Control siRNA作用HKC細胞24小時后,再用TGF-β1處理細胞48小時,Western blot及Real-Time PCR檢測E-cadherin、α-SMA及FN的蛋白和mRNA的表達。
　　 結果：
　　 1.TGF-β1以時間依賴的方式上調HKCα-SMA

11、蛋白(F=4.546,P=0.039)及mRNA表達(F=18.537,P=0.001),增加FN蛋白(F=5.784,P=0.015)及mRNA表達(F=20.468,P=0.002),而下調E-cadherin蛋白(F=7.457,P=0.011)及mRNA表達(F=19.246,P=0.001)。
　　 2.TGF-β1以時間依賴的方式上調HKC細胞Kindlin-2蛋白(F-4.275,P=0.028)和mRNA(F=1

12、6.909,P=0.000)的表達,同時,TGF-β1以劑量依賴的方式誘導HKC細胞Kindlin-2蛋白(F=4.732,P=0.021)和mRNA(F=5.843,P=0.021)的表達。
　　 3.短暫過表達Kindlin-248小時后,與Flag組相比,轉染Flag-Kindlin2的HKC細胞中α-SMA蛋白(t=-2.905,P=0.044)及mRNA表達顯著上調(t=-4.069,P=0.015),同樣FN的表達明

13、顯增加。而E-cadhcrin蛋白(t=3.135,P=0.035)及mRNA(t=4.546,P=0.010)表達顯著下調。
　　 4.穩(wěn)定表達Kindlin-2后,HKC的形態(tài)學發(fā)生改變,從原來的鵝卵石狀變成長梭形。穩(wěn)定表達Kindlin-2后,HKC細胞中α-SMA和FN蛋白及mRNA表達顯著上調,E-cadhcdn蛋白和mRNA表達顯著下調。
　　 5.Kindlin-2 siRNA作用于HKC細胞后抑制TGF-

14、β1誘導的α-SMA蛋白(F=5.774,P=0.021)和mRNA(F=16.663,P=0.001)表達,同樣顯著抑制FN蛋白(F=18.046,P=0.001)和mRNA(F=19.035,P=0.000)的表達。而Kindlin-2siRNA能恢復被TGF-β1抑制的E-cadherin蛋白(F=12.054,P=0.002)和mRNA(F=7.218,P=0.012)的表達。
　　 結論：
　　 1.TGF—β

15、1以劑量和時間依賴的方式上調HKC細胞Kindlin-2的表達。
　　 2.Kindlin-2可以誘導HKC細胞的α-SMA和Fibronectin表達,抑NE-cadherin的表達,促進HKC細胞的EMT。
　　 3.TGF-β1誘導HKC細胞的EMT需要Kindlin-2的參與。
　　 第二章 Kindlin-2參與TGF-β1信號通路的機制研究
　　 目的
　　 研究Kindlin-2與S

16、mad3及TGF-β1受體的關系,探索Kindlin-2在TGF-β-Smad3信號通路中發(fā)揮的作用。
　　 方法
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)HKC細胞,實驗分組為:轉染空載Flag組、轉染Flag-Kindlin-2組、轉染空載Flag或Kindlin-248小時后加TGF—β1處理30分鐘組,分別提取細胞總蛋白,Western blot檢測Smad3的磷酸化。
　　 2.實驗分組為:轉染Control siRNA72

17、小時組、轉染Kindlin-2 siRNA72小時組、轉染control siRNA或Kindlin-2 SiRNA72小時后加TGF-β1處理30分鐘組,分別提取細胞總蛋白和核蛋白,Western blot檢測Smad3的磷酸化。
　　 3.實驗分組為:共轉染Control siRNA及Flag空載72小時組、共轉染Control siRNA及Flag空載72/b時后加TGF-β1處理30分鐘組、共轉染Kindlia-2 si

18、RNA及Flag空載72小時后加TGF-β1處理30分鐘組和共轉染Kindlin-2 siRNA及抵抗Kindlin-2 siRNA的質粒72小時后TGF-β1處理30分鐘組,提取細胞總蛋白,Western blot檢測Smad3的磷酸化。
　　 4.轉染Flag-Kindlin-2至HKC細胞中,免疫共沉淀檢測Kindlin-2與Smad3的相互作用。
　　 5.轉染Flag-Kindlin-2-N端或C端至HKC細胞

19、中,GST-pull down檢測Kindlin-2與Smad3相互作用的區(qū)域定位。
　　 6.共轉染Flag-Kindliw2及HA-TβRⅠ或Flag-Kindlin-2及HA-TβRⅡ至HKC細胞中,免疫共沉淀檢測Kindlin-2與TβRⅠI和TβRⅡ的相互作用。
　　 7.共聚焦熒光顯微鏡觀察Kindlin-2與Smad3、TβRⅠ和TβRⅡ的共定位。
　　 8.免疫共沉淀檢測敲低Kindlin-2后對

20、Smad3與TβRⅠ的結合的影響。
　　 結果
　　 1.Kindlin-2干預HKC細胞后,與對照組一樣均不能引起Smad3的磷酸化。在分別轉染Flag或Flag-Kindlin-248小時后再用TGF-β1作用30分鐘后,與Flag組相比,Kindlin-2明顯增加Smad3的磷酸化。
　　 2.Kindlin-2 siRNA處理HKCC細胞72小時后再與TGF-β1作用30分鐘,Kindlin-2siRNA

21、明顯抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化及Smad3的核轉移。而抵抗Kindlin-2siRNA的質粒有效恢復被Kindlin-2siRNA抑制的TGF-β1誘導的Smad3的激活。
　　 3.HKC細胞中轉染Flag-Kindlin-2,免疫共沉淀結果顯示Kindlin-2與Smad3有相互作用。GST-pull down結果顯示,Smad3的MH1段與Kindlin-2的N端有較強的相互作用,未觀察到Smad3的MH1段

22、與Kindlin-2的C端的相互作用,Smad3的MH2段與Kindlin-2的N端及C端均沒有相互作用。
　　 4.在HKC細胞中分別共轉入Flag-Kindlin-2和HA-TβRⅠ或Flag-Kindlin-2和HA-TβRⅡ,免疫共沉淀結果顯示,Kindlin-2和TβRⅠ及TβRⅡ均具有相互作用。
　　 5.HKC中轉染Flag-Kindlin-2,免疫共沉淀結果顯示Kiadlin-2與Smad3及TGF-β1

23、受體形成復合物。
　　 6.共聚焦熒光顯微鏡觀察結果證明Kindlin-2與Smad3、TβRⅠ及TβRⅡ具有共定位。在正常狀態(tài)下,定位區(qū)域主要分布在細胞膜上。在加入TGF-β1刺激后,Kindlia-2與Smad3在細胞核內具有共定位。
　　 7.免疫共沉淀結果顯示Kindlia-2 siRNA抑制Smad3與TβRⅠ的結合,從而抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化。
　　 結論
　　 1.Kind

24、lin-2不能激活Smad3,但是Kindlin-2與TGF-β1具有協(xié)同作用激活Smad3。
　　 2.TGF-β1引起Smad3的磷酸化需要Kindlin-2的參與。
　　 3.Kindlin-2分別與Smad3、TβRⅠ及TβRⅡ相互作用并形成復合物,在分布上發(fā)生共定位。
　　 4.敲低Kindlin-2后抑制Smad3與TGF-β1RⅠ的結合。
　　 第三章 Kindlin-2在腎臟纖維化中發(fā)揮重

25、要作用
　　 目的
　　 通過動物實驗探討Kindlin-2在腎臟纖維化中發(fā)揮的作用；檢測患有慢性腎病的臨床病人腎臟組織中Kindlin-2及p-Smad3的表達,探索Kindlin-2在慢性腎病中的作用并觀察Kindlin-2及p-Smad3表達的相關性。
　　 方法
　　 1.ICR小鼠隨機分為:注射Control siRNA假手術組(Control siRNA+Sham組),Control siRN

26、A單側輸尿管結扎(UUOO)模型組(Control siRNA+UUO組)及Kindlin-2 siRNA模型組(Kindlin-2 siRNA+UUO)。采用單側(左)輸尿管結扎方法,建立梗阻性腎小管間質纖維化小鼠模型,Sham組只游離輸尿管而不結扎,在術前一周和術后一周內通過尾靜脈注射Control siRNA或Kindlin-2 siRNA。術后7天處死動物,取出腎臟,分別用于免疫組織化學、Western blot和Real-Ti

27、me PCR。
　　 2.運用HE及Masson染色觀察腎臟組織形態(tài)學改變及膠原纖維的沉積,采用免疫組織化學法檢測測Kindlin-2、p-Smad3、α-平滑肌肌動蛋白(α—SMA)及纖維連接蛋白(Fibronectin)表達的部位和變化。
　　 3.Westernblot檢測Kindlin-2、p-Smad3、Smad3、α-SMA及Fibronectin的蛋白表達。Real-Time PCR檢測Kindlin-2、

28、α-SMA及Fibronectin的mRNA表達。
　　 4.利用免疫組織化學方法檢測病人標本中Kindlin-2及p-Smad3的表達。
　　 結果
　　 1.HE染色顯示:與假手術組比較,UUO模型組小鼠腎組織出現(xiàn)不同程度的腎小管擴張或部分腎小管萎縮、間質面積增寬、間質炎癥細胞浸潤。而Kindlin-2siRNA+UUO組,腎臟纖維化癥狀明顯改善。
　　 2.Masson染色結果顯示:與假手術組比較,

29、UUO模型組小鼠腎組織膠原在腎小球及間質區(qū)顯著增多。而在Kindlin-2 siRNA+UUO組,膠原沉積癥狀明顯減少。
　　 3.免疫組化結果表明:Kindlin-2主要分布在腎小管細胞胞質中,細胞核中也有表達,p-Smad3只分布在細胞核中,α-SMA及Fibronectin只分布在小管間質中。與假手術組比較,UUO模型組小鼠腎組織Kindlin-2、p-Smad3、α-SMA及Fibronectin表達顯著增加。而Kind

30、lin-2 siRNA+UUO組,這些蛋白表達均明顯減少。
　　 4.Western blot結果證明:與假手術組相比,UUO模型組小鼠腎組織Kindlin-2、p-Smad3、α-SMA及Fibronectin的蛋白表達顯著增加,而Kindlin-2 siRNA+UUO組,Kindlin-2(F=18.540,P=0.003)、p-Smad3(F=14.735,P=0.005)、α-SMA(F=27.928,P=0.001)及

31、Fibronectin(F=56.200,P=0.000)蛋白表達均明顯減少。
　　 5.Real-Time PCR結果發(fā)現(xiàn):與假手術組比較,UUO模型組小鼠腎組織Kindlin-2、α-SMA及Fibronectin mRNA表達顯著增加,而Kindlin-2 siRNA+UUO組,Kindlin-2(F=9.913,P=0.013)、α-SMA(F=8.175,P=0.019)及Fibronectin(F=80.396,P=

32、0.000)mRNA表達均明顯減少。
　　 6.病人標本免疫組織化學顯示:與正常腎臟相比,患有腎臟纖維化的病人的腎組織中Kindlin-2及p-Smad3顯著增加,并且兩者具有正相關。
　　 結論
　　 1.在小鼠單側輸尿管結扎模型中,Kindlin-2、P-Smad3、α-SMA和Fibronectin及表達顯著上調。
　　 2.敲低Kindlin-2有效減輕單側輸尿管結扎小鼠的腎臟纖維化。