雌激素及其代謝產(chǎn)物對(duì)去勢(shì)低氧肺動(dòng)脈高壓大鼠AlkB和HIF-1α表達(dá)的影響.pdf

1、目的:肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是一類致病因素、發(fā)病機(jī)制、病理變化、臨床表現(xiàn)、可逆性及治療方法均不完全相同的疾病，以血管增殖、重塑、原位血栓形成、肺血管進(jìn)行性閉塞，肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)進(jìn)行性增加為特征，肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高，常常導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡。其中缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxicpulmonary hypertension，HPH)的

2、形成主要與早期的低氧性肺血管收縮（hypooxygen pulmonary vasculation, HPV）和后期的肺血管重建(pulmonaryvascular reconstruction，PVR)有關(guān)。在缺氧條件下，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainducible factor-1，HIF-1α)可以激活下游靶基因，繼而調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)介質(zhì)的表達(dá)以及蛋白質(zhì)合成，在血管反應(yīng)性、血管重建、血管生成以及細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮著重要作

3、用。體內(nèi)產(chǎn)生的天然雌激素有3種，即17β-雌二醇(E2)、雌酮及雌三醇，其中17β-雌二醇的生物活性及其與靶組織雌激素受體結(jié)合的效能最強(qiáng)，被認(rèn)為是起主要生理作用的雌激素。近年來，雌激素對(duì)肺血管起保護(hù)作用的相關(guān)研究日益增多，不僅可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的功能損傷，還可以舒張血管、改善肺血管重構(gòu)，但其具體機(jī)制尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)建立去勢(shì)大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，探討17β-雌二醇(E2)及2甲氧基雌二醇(2ME)對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模

4、型中烷烴單加氧酶(AlkB)和HIF-1α的影響。
　　方法:
　　1、建立模型:選6-7周左右雌性SD大鼠60只，先行去勢(shì)手術(shù)并適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。去勢(shì)手術(shù)步驟如下:大鼠麻醉后，取仰臥位，常規(guī)備皮消毒鋪巾后打開腹腔，先沿輸卵管找到雙側(cè)卵巢，結(jié)扎其下方輸卵管及營(yíng)養(yǎng)血管后予以切除，逐層縫合筋膜、皮膚，局部予以慶大霉素預(yù)防感染。之后采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為6組:常氧組、常氧+E2干預(yù)組、常氧+2ME干預(yù)組、低氧組、低氧+E2干預(yù)

5、組、低氧+2ME干預(yù)組。低氧組、低氧+E2干預(yù)組、低氧+2ME干預(yù)組大鼠放入低氧箱中飼養(yǎng)，調(diào)整低氧箱參數(shù)，保持艙內(nèi)氧濃度為10.0±0.5％，并放置鈉石灰和無水CaCl2以吸收CO2和H2O，將CO2濃度控制在0.5％以內(nèi)，每天24小時(shí)持續(xù)低氧，共8周。常氧組、常氧+E2干預(yù)組、常氧+2ME干預(yù)組大鼠，除吸入空氣外，其它飼養(yǎng)條件與低氧組一致。常氧+2ME干預(yù)組、低氧+2ME干預(yù)組從造模開始，每天予以2甲氧基雌二醇240μg/kg皮下注射

6、。常氧+E2干預(yù)組、低氧+E2干預(yù)組予以17-β雌二醇20μg/kg皮下注射。常氧組、低氧組則每天予以等量的生理鹽水皮下注射。
　　2、觀察大鼠一般狀況變化，造模8周后稱重，以右心導(dǎo)管測(cè)量法測(cè)出大鼠肺動(dòng)脈壓力值，繼而算出平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterypressure，mPAP)，以稱量法測(cè)出左右心室及室間隔重量，通過公式算出右室肥厚指數(shù)(right ventricule hypertrophy index

7、，RVHI)，以HE染色對(duì)肺小動(dòng)脈重塑(hypoxic pulmonary artery remodeling，HPSR)觀察。
　　3、應(yīng)用RT-PCR測(cè)定肺組織中AlkB和HIF-1 mRNA水平。
　　4、應(yīng)用Western blot測(cè)定肺組織中AlkB和HIF-1蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠的一般狀況
　　低氧條件下飼養(yǎng)的大鼠逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、體重下降、體毛晦暗易脫落、呼吸頻率加快、活動(dòng)度下

8、降，最終以靜臥為主，低氧8周過程中未出現(xiàn)死亡。與常氧條件下飼養(yǎng)的大鼠比較，低氧條件下的大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2、大鼠血流動(dòng)力學(xué)改變(mPAP)
　　與常氧條件下大鼠比較，低氧條件下的三組大鼠mPAP明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，符合肺動(dòng)脈高壓的壓力水平;其中低氧組大鼠的mPAP較低氧情況下的其他2組，即低氧+2ME組、低氧去+E2組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而這2組大鼠

9、mPAP無明顯差別，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3、大鼠肺小血管及右心室形態(tài)學(xué)變化
　　光鏡下，常氧條件下的三組大鼠肺動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)均一扁平，細(xì)胞分布均勻連續(xù)，無細(xì)胞水腫或壞死;而低氧條件下的三組大鼠肺動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，細(xì)小動(dòng)脈中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖明顯，中膜(PAMT)肥厚;低氧+E2組及低氧+2ME組肺動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)介于正常組及低氧組之間;(見Fig.1)。各組右心肥厚指數(shù)即RV/(L

10、V+SP)比值的變化趨勢(shì)同mPAP變化。
　　4、大鼠肺組織中HIF-1 mRNA及AlkBmRNA表達(dá)水平的變化
　　應(yīng)用RT-PCR測(cè)定HIF-1αmRNA表達(dá)水平在低氧組顯著高于常氧組(P＜0.05)，低氧+E2干預(yù)組、低氧+2ME干預(yù)組亦升高（均P＜0.05），升高幅度不及低氧組，常氧+E2干預(yù)組、常氧+2ME干預(yù)組無明顯變化(均P＞0.05)。AlkBmRNA表達(dá)水平在低氧組顯著低于常氧組(P＜0.05)，低氧+E

11、2干預(yù)組、低氧+2ME干預(yù)組亦降低（均P＜0.05），降低幅度不及低氧組，常氧+E2干預(yù)組、常氧+2ME干預(yù)組無明顯變化（均P＞0.05）。
　　5、大鼠肺組織中HIF-1及AlkB蛋白水平的變化
　　應(yīng)用Western blot測(cè)定HIF-1α蛋白表達(dá)水平在低氧組顯著高于常氧組(P＜0.05)，低氧+E2干預(yù)組、低氧+2ME干預(yù)組亦升高（均P＜0.05），升高幅度不及低氧組，常氧+E2干預(yù)組、常氧+2ME干預(yù)組無明顯變化（

12、均P＞0.05）。AlkB蛋白表達(dá)水平在低氧組顯著低于常氧組(P＜0.05)，低氧+E2干預(yù)組、低氧+2ME干預(yù)組亦降低（均P＜0.05），降低幅度不及低氧組，常氧+E2干預(yù)組、常氧+2ME干預(yù)組無明顯變化（均P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、肺組織內(nèi)HIF-1及AlkB的差異性表達(dá)可能在大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。
　　2、在低氧條件下，ALKB可能通過其表觀遺傳學(xué)特性的改變進(jìn)而影響HIF-1的