HSF1對大鼠發(fā)熱過程中PO-AH區(qū)TRPV1表達的影響.pdf

1、前言:
　　生物體在高溫、毒物及感染等應激原的作用下，表現(xiàn)出熱休克反應，這一反應主要通過熱休克轉錄因子1(HSF1)誘導相關蛋白的表達，從而保護機體免受應激的損傷。在正常情況下，HSF1存在于胞漿中且呈無活性的單體形態(tài);當機體處于高溫、缺氧等應激刺激下，HSF1便進入細胞核，且由無活性的單體向三聚體轉化。細胞中HSP70的合成將明顯增加，從而增強機體抵抗熱損傷的能力。
　　本實驗室已證實，Trpv1是一種HSF1的靶基因，我

2、們推測在下丘腦組織中，HSF1可能是機體發(fā)熱過程中又一種重要的保護應答元件。然而目前還沒有HSF1影響TRPV1蛋白表達水平的直接證據(jù)。因此，本實驗將探討HSF1的激活對TRPV1蛋白表達的影響，進一步地明確HSF1與TRPV1在體溫調節(jié)中的相互關系與作用機制。
　　本實驗室以往的研究結果顯示，HSF1激活后可通過降低cAMP、PGE2等中樞正調節(jié)介質的含量而限制體溫升高，TRPV1也可通過降低PGE2的含量限制體溫升高。因此，本

3、實驗還將探討HSF1激活對PGE2的抑制作用是不是通過增加TRPV1表達水平而實現(xiàn)的。
　　材料與方法:
　　一、實驗動物及處理
　　(1)實驗動物
　　選用健康雄性清潔級SD大鼠，體重250～280g，基礎體溫（38±0.2）℃，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼育室溫度(20±2)℃，相對濕度40％-60％，晝夜光照節(jié)律12h∶12h，單籠飼養(yǎng)，自由進食水。實驗中各項操作按常規(guī)無菌規(guī)則進行。
　　(2)

4、實驗分組
　　實驗1:在LPS致熱大鼠過程中，HSF1對PO/AH區(qū)TRPV1表達以及PGE2含量的影響
　　將動物隨機分為6組:(1)正常對照組(N1): PO/AH區(qū)注入溶劑1μl(1％無水乙醇+6％Tween80+93％生理鹽水)，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(2)槲皮素組(Q): PO/AH區(qū)注入槲皮素（0.075mol/L）1μl，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(3) AMG9

5、810組(A)，PO/AH區(qū)注入AMG9810，按6μg·kg-1用無水乙醇+生理鹽水配制成1μ1，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(4) LPS組(L)，PO/AH區(qū)注射溶劑1μl，30min后經(jīng)腹腔注射LPS4ml·kg-1（20μg·ml-1，用生理鹽水配制）;(5) LPS+槲皮素組(L+Q)，PO/AH區(qū)注入槲皮素1μl，劑量同前，30min后經(jīng)腹腔注射LPS4ml·kg-1;(6) LPS+AMG9810組(

6、L+A)，PO/AH區(qū)注射AMG98101μl，劑量同前，30min后經(jīng)腹腔注射LPS4ml·kg-1。
　　實驗2:大鼠物理加溫處理，檢測HSF1對PO/AH區(qū)TRPV1表達的影響
　　將動物隨機分為5組:將動物隨機分為4組:(1)正常對照組(N2)，PO/AH區(qū)注入溶劑1μl，30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(2)槲皮素組(Q)，PO/AH區(qū)注入槲皮素（0.075mol/L）1μl，30min后經(jīng)腹腔注射

7、生理鹽水4ml·kg-1;(3)物理加溫組(H)，將大鼠置于人工氣候室，室溫控制39℃，相對濕度保持50％，持續(xù)2h;(4)物理加溫+槲皮素組(H+Q)，PO/AH區(qū)注入槲皮素1μl，劑量同前，30min后將大鼠置于人工氣候室，操作如前。
　　(3)大鼠下丘腦PO/AH區(qū)插管、體溫測量發(fā)射子植入和物理加溫處理
　　下丘腦PO/AH區(qū)插管:將大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)+25％烏拉坦以1:1比例腹腔麻醉，然后將其頭部固

8、定于立體定位儀上，暴露前囟。參照大鼠腦圖譜，左側PO/AH區(qū)(anterior:-0.3 mm，lateral:-0.8mm，ventral:+6.7 mm)插入一根不銹鋼管(23ga)，并留置與之相匹配的針芯，最后用牙科水泥固定。
　　體內植入測量體溫的發(fā)射予:在麻醉狀態(tài)下，于大鼠腹腔植入遙測系統(tǒng)發(fā)射子。術后動物單籠飼養(yǎng)，恢復一周后進行實驗。
　　物理加溫處理:將大鼠置于人工氣候室，室溫控制在39℃，相對濕度50％，保持2

9、小時。
　　二、體溫測量
　　應用BW-200生理無線遙測系統(tǒng)測量大鼠體溫。實驗前一日早上8時開始記錄大鼠基礎體溫，每隔30分鐘測量體溫1次，共測量6小時，取其平均值記為基礎體溫。實驗均在早8時開始，各組在相應處理后開始監(jiān)測體溫變化，每隔5分鐘自動記錄體溫一次，直到實驗結束。
　　三、Western blotting檢測下丘腦PO/AH區(qū)HSF1三聚體表達量
　　取大鼠PO/AH區(qū)的腦組織，冰浴勻漿，4℃離心(1

10、2000 r·min-1，30 min)兩次，取上清。進行蛋白定量后，向蛋白質提取液中加入緩沖液（不含β-巰基乙醇），各樣品稀釋成同一濃度。各取總量為50μg的蛋白質（未經(jīng)煮沸變性），通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉，加兔抗大鼠HSF1單克隆抗體(1∶1000)，二抗為羊抗兔IgG，ECL化學發(fā)光法顯色，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析。對照選用抗β-肌動蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應β-actin蛋白的灰度比值作為該目的

11、蛋白的相對表達量。
　　四、Western blotting檢測下丘腦PO/AH區(qū)TRPV1表達量
　　取大鼠PO/AH區(qū)的腦組織，冰浴勻漿，4℃離心(12000 r·min-1，30 min)兩次，取上清。進行蛋白定量后，電泳、轉膜、封閉，加小鼠抗大鼠TRPV1單克隆抗體(1∶1000)，二抗為羊抗小鼠IgG，ECL化學發(fā)光法顯色，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析。對照選用抗β-肌動蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應β-a

12、ctin蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。
　　五、腦內PGE2含量的測定
　　大鼠處死后，迅速取出下丘腦PO/AH區(qū)50 mg，加入1ml PBS(pH7.4)（預先4℃冰?。?，檢測時樣本在冰浴中進行處理，用勻漿器將標本制成組織勻漿。離心20分鐘（2000-3000轉/分），取上清放于-20℃?zhèn)溆?。按照PGE2酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書操作。PGE2含量用(ng· L-1)表示。
　　六、數(shù)據(jù)分析
　　所有

13、實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，各組均數(shù)間差異的比較應用t檢驗，相關分析用相關性檢驗分析法。
　　實驗結果:
　　實驗1:在LPS致熱大鼠過程中，HSF1對PO/AH區(qū)TRPV1表達以及PGE2含量的影響
　　HSF1三聚體表達水平:N1組、Q組和A組無顯著差異;L組則明顯高于N1組，但與L+A組無顯著差異;L+Q組略低于L組，但仍顯著高于N1組。
　　TRPV1表達水平:N1組、Q組和A組無顯著差異

14、;L組則明顯高于N1組;L+Q組和L+A組均低于L組，但仍顯著高于N1組;L+Q組、L+A組兩者無明顯差異。
　　體溫:大鼠腹腔注射LPS（L組）可引起體溫升高，在4h時體溫達到高峰，隨后開始降低，在發(fā)熱期間L組各采樣時間點與正常組(N1組)比較體溫變化均有顯著性差異(P＜0.01)。當預先在PO/AH區(qū)給予Que后腹腔注射LPS，即在L+Q組體溫也出現(xiàn)明顯升高，且經(jīng)過5h體溫仍呈現(xiàn)升高趨勢，且與N1組和Q組比較各采樣時間點體溫變

15、化值均有顯著性差異(P＜0.01);與L組相比，發(fā)熱幅度升高，在4～5h期間，兩組△T差異顯著，表現(xiàn)為發(fā)熱時程延長。當預先在PO/AH區(qū)給予AMG9810后腹腔注射LPS，即在L+A組體溫也出現(xiàn)明顯升高，且經(jīng)過5h體溫仍呈現(xiàn)升高趨勢，與N1組和A組比較各采樣時間點體溫變化值均有顯著性差異(P＜0.01);與L組相比，發(fā)熱幅度升高，在4～5h期間，兩組△T差異顯著，也表現(xiàn)為發(fā)熱時程延長。
　　PGE2含量:在L組、L+Q組和L+A組

16、PO/AH區(qū)中的PGE2含量分別是391.199±13.264、509.161±9.944和497.961±17.876，與N1組的283.305±15.293比較差異均有統(tǒng)計學意義;L+Q組和L+A組PGE2含量高于L組，差異有統(tǒng)計學意義，但L+Q組和L+A組之間比較無顯著差異;Q組和A組的PGE2含量分別是297.313±13.044和281.753±14.435，與N1組比較差異均無統(tǒng)計學意義。
　　實驗2:大鼠物理加溫處理

17、，檢測HSF1對P0/AH區(qū)TRPV1表達的影響
　　HSF1三聚體表達水平:H組明顯高于N2組，H+Q組略低于H組。Q組與N2組比較無顯著差異。
　　TRPV1表達水平:H組明顯高于N2組，而H+Q組略低于H組。Q組與N2組比較無顯著差異。
　　體溫:將大鼠置于人工氣候室（H組）可引起體溫升高，與N2組比較各采樣時間點體溫變化值均有顯著性差異(P＜0.01);當預先在PO/AH區(qū)給予Que后再置于人工氣候室（H+Q組