旋毛形線蟲與約氏瘧原蟲共同感染對BALB-c小鼠抗瘧免疫應(yīng)答影響的研究.pdf

1、目的：
　　大量的研究數(shù)據(jù)顯示，在瘧疾流行區(qū)，瘧疾與蠕蟲病的混合感染普遍存在，并且混合感染成為這些國家和地區(qū)主要的致病和死亡原因。瘧疾和蠕蟲混合感染的相關(guān)免疫學(xué)機制十分復(fù)雜，免疫應(yīng)答的時效與強度影響宿主瘧原蟲感染的感染模式與結(jié)局?；旌细腥镜拿庖呦嚓P(guān)機制有許多未知數(shù)，其所涉及的公共衛(wèi)生問題仍然具有意義。因此，探討瘧疾流行區(qū)瘧原蟲與蠕蟲之間的相互作用特點，尤其是蠕蟲感染對瘧疾免疫應(yīng)答的影響及其相關(guān)分子機制，可為抗瘧研究提供重要的策略。

2、
　　旋毛形線蟲作為食源性感染和分布廣泛的重要病原體，目前仍是瘧疾流行區(qū)與瘧原蟲混合感染的危險因素之一。本研究采用預(yù)感染旋毛形線蟲小鼠模型再感染致死型約氏瘧原蟲，動態(tài)觀察旋毛形線蟲混合感染對瘧疾感染進程與最終結(jié)果的影響，并著重探討T細胞在感染過程中的變化以及這些變化對宿主免疫力和預(yù)后的影響，旨在進一步揭示旋毛形線蟲與約氏瘧原蟲共同感染的相關(guān)細胞和分子機制，以期為瘧疾流行區(qū)新的防控策略的確定提供思路。
　　方法：
　　一

3、、實驗動物及其模型建立
　　54只雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，每組18只。旋毛形線蟲單獨感染對照組小鼠(TS)和實驗組小鼠(TSPY)分別經(jīng)口感染200只旋毛形線蟲感染期幼蟲，感染1w后TSPC組經(jīng)腹腔感染1×106約氏瘧原蟲寄生的紅細胞，構(gòu)建混合感染模型。約氏瘧原蟲單獨感染對照組(PY)在同一時間點單純感染約氏瘧原蟲。
　　二、原蟲血癥檢測及生存率觀察
　　混合感染模型制備成功后，每天隨機取3只小鼠，經(jīng)尾靜脈采

4、血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計數(shù)紅細胞感染率并記錄小鼠生存率變化。
　　三、脾細胞熒光抗體染色
　　無菌取出感染前0d和感染后3d、5d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10％胎牛血清(FAS)的RMI1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/ml。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1mL，每份樣品加入抗CD4-FITC單抗進行表

5、面染色，另設(shè)陰性對照管。固定透明后，用抗IFN-γ-PE單抗、抗Gata-3-PE單抗進行胞內(nèi)染色。用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μLPBS中，流式細胞儀(BectonDickinson，USA)進行檢測。每份樣品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE單抗進行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進行胞內(nèi)染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μLPBS中，流式細胞儀進行檢測。
　　四、IFN-γ

6、、IL-6及IL-10定量檢測
　　用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-6及IL-10的分泌水平。操作過程按照試劑盒說明書進行操作，酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　五、轉(zhuǎn)錄因子分析
　?。ㄒ唬㏑NA提取及cDNA合成
　　采用Trizol一步法提取脾細胞總R

7、NA，用紫外分光光度計測定RNA的含量。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，置-20℃保存。
　?。ǘ┮镌O(shè)計
　　通過PrimerS.0在線軟件設(shè)計Foxp3，Gata-3，T-bet以及GAPDH實時定量PCR引物序列。
　?。ㄈ晒舛縋CR檢測T-bet，Gata-3及Foxp3 mRNA表達水平
　　利用SYBR GreenⅡ染料進行各基因的實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系(共

8、20μL)，共40個循環(huán)。為消除樣本處理、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)差異，每個樣品GAPDH、T-bet、Gata-3及Foxp3基因同時檢測3次，取平均值。
　?。ㄋ模┙y(tǒng)計學(xué)分析
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標(biāo)本采用獨立樣本t-檢驗比較分析組內(nèi)和組間均值差異。P小于0.05為差異顯著。
　　結(jié)果：
　　一、原蟲血癥檢測及生存率觀察
　　與PY組相比，TSPY組感染后第2d，小鼠的外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染

9、的紅細胞，原蟲血癥出現(xiàn)時間推遲。隨后，BALB/c小鼠原蟲血癥迅速上升，至感染后5d達到峰值，PY組峰值為64.24％，TSPY組為38.62％（峰值降低）。TSPY組在P.y17XL感染4d后相對于PY組明顯下降，并且有統(tǒng)計學(xué)意義。TS組小鼠全部存活，而TSPY組生存時間與TS組相比延長兩天。
　　二、小鼠脾細胞懸液細胞數(shù)量檢測
　　（一）CD4+IFN-γ+T細胞數(shù)量檢測
　　與感染前相比，感染后3d、5d，TS組

10、、TSPY組小鼠CD4+ IFN-γ+T細胞均出現(xiàn)明顯增加，而PY組小鼠于感染后3d，CD4+ IFN-γ+T細胞出現(xiàn)明顯增加。TSPY組小鼠于感染后3d，CD4+ IFN-γ+T細胞顯著高于PY組小鼠。
　　（二）CD4+ Gata-3+T細胞數(shù)量檢測
　　與感染前相比，感染后3d，PY組小鼠CD4+ Gata-3+T細胞出現(xiàn)明顯增加，然后迅速下降。TSPY組與PY組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　?。ㄈ〤D4+ CD25+

11、 Foxp3+ Treg細胞數(shù)量檢測
　　與感染前相比，感染后3d、5d，PY組小鼠Treg細胞數(shù)量出現(xiàn)明顯增加，感染后5d，TSPY組小鼠Treg細胞數(shù)量出現(xiàn)明顯增加。TSPY組小鼠于感染后5d，Treg細胞數(shù)量顯著低于PY組小鼠。
　　三、小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子檢測
　?。ㄒ唬㊣FN-γ水平檢測
　　與感染前相比，感染后第3d、5d，TS組與TSPY組小鼠脾細胞IFN-γ分泌水平增加。PY組小鼠于感染后

12、第3d，IFN-γ分泌水平明顯增加。TSPY組小鼠于感染前及感染后第3d，IFN-γ分泌水平顯著高于PY組小鼠。
　?。ǘ㊣L-6水平檢測
　　與感染前相比，感染后3d，PY組與TSPY組小鼠IL-6分泌水平增加，然后迅速下降。TSPY組與PY組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　（三）IL-10水平檢測
　　與感染前相比，感染后3d、5d，PY組小鼠IL-10分泌水平增加，感染后5d，TSPY組小鼠IL-10分泌水平增加

13、，TSPY組小鼠于感染后5d，IL-10分泌水平顯著低于PY組小鼠。
　　四、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾細胞懸液中轉(zhuǎn)化因子檢測
　?。ㄒ唬㏕-bet水平檢測
　　與感染前相比，感染后第5d，TS組小鼠脾細胞T-bet表達增加。PY組與TSPY組小鼠于感染后第3d，T-bet表達明顯增加。TSPY組小鼠于感染后第3d，T-bet表達水平顯著高于TS組小鼠。
　?。ǘ〨ata-3水平檢測
　　與感染前

14、相比，感染后3d，PY組與TSPY組小鼠Gata-3表達增加，然后迅速下降。TSPY組與PY組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　（三）Foxp3水平檢測
　　與感染前相比，感染后3d、5d，PY組小鼠Foxp3表達增加，感染后3d，TSPY組小鼠Foxp3表達增加，TSPY組小鼠于感染后5d，F(xiàn)oxp3表達水平顯著低于PY組小鼠。
　　結(jié)論：
　　1、旋毛形線蟲預(yù)感染對P.y17XL感染的小鼠具有免疫保護作用;