約氏瘧原蟲子孢子與小鼠骨髓來源DC的相互作用研究.pdf

1、瘧疾是蚊媒傳播的一種嚴重危害人類健康的熱帶傳染病,在全世界有很高的發(fā)病率和致死率。疫苗是控制瘧疾發(fā)病和阻止其傳播的有效的方法,減毒子孢子疫苗雖然能夠誘導宿主有效的抗瘧原蟲反應,但是因為材料來源等條件的限制而難以應用于現(xiàn)場。因而有效的亞單位疫苗的研制仍然是目前瘧疾疫苗研究的重點,對紅前期瘧原蟲免疫機制的深入研究對紅前期亞單位疫苗的設計具有重要的指導意義。
　　 DC作為體內重要的抗原遞呈細胞,是架接宿主紅前期特異天然免疫及適應性免

2、疫的橋梁。最近的研究表明,感染瘧原蟲的按蚊叮咬宿主后,瘧原蟲子孢子侵入宿主皮下,部分子孢子可以進入毛細淋巴管,甚至可見少量子孢子在進入DC后仍可以進行一段時間的發(fā)育,而該部位的DC在啟動紅前期特異的CD8+T細胞的免疫反應,參與清除感染瘧原蟲的肝細胞中發(fā)揮重要作用。然而,進入毛細淋巴管中的子孢子是主動侵入DC還是被DC吞噬,及其對DC成熟誘導的作用和機制仍不清楚,對其機制的深入研究對闡明DC在紅前期保護性免疫的產生中的作用具有重要的意義

3、。
　　 本研究首先通過構建約氏瘧原蟲子孢子與小鼠骨髓來源DC(bonemarrow-dendritic-cells,BMDC)體外共培養(yǎng)平臺,然后利用熒光顯微鏡技術觀察子孢子與DC之間的相互作用,檢測子孢子是否主動侵入DC;其次利用流式細胞技術檢測對應時段DC的共刺激分子的變化情況;最后轉染重組質粒pFLAG-CMV8-CSP至DC中,流式檢測其對相關共刺激分子的影響,研究子孢子與DC相互作用及初步探討其分子機制。研究主要包括

4、兩個方面:
　　 一、子孢子誘導小鼠骨髓來源DC成熟:
　　 1、子孢子與小鼠骨髓來源DC共培養(yǎng)的形態(tài)學觀察:分離并誘導培養(yǎng)小鼠骨髓DC,第7天后與EGFP-BY265子孢子共培養(yǎng)2h、4h和24h后,熒光顯微鏡觀察子孢子與DC的作用情況,發(fā)現(xiàn)大部分子孢子可以侵入DC,24h后瘧原蟲為類似肝期裂殖體的形態(tài),說明子孢子可以侵入DC,并在DC內進行發(fā)育。
　　 2、侵入的子孢子誘導DC成熟:子孢子與DC共培養(yǎng)2h、4

5、h和24h后檢測DC表面成熟相關共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達情況?？梢?h時,MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達與正常DC對照組相似,無明顯變化。4h時,加入子孢子的實驗組MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達較對照組有所上調。24h時,MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達上調比4h時更明顯,基本達到LPS的陽性對照組的誘導水平。說明侵入的子孢子可以誘導DC成熟,從而為激活紅前期特異的CD8+T細胞的反應提供重要的前提

6、條件。
　　 二、轉染pFLAG-CMV8-CSP誘導DC成熟:
　　 環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)是瘧原蟲子孢子主要的表面蛋白。自然感染情況下,子孢子在CSP和TRAP的介導下,能主動侵入KC,并躲藏于納蟲空泡內,避免吞噬溶酶體內各種酶對子孢子的殺傷作用。位于納蟲空泡內子孢子表面蛋白CSP在pexel功能域的作用下,能轉移到肝細胞漿內,推測CSP可能參與入侵的子孢子對DC成熟

7、的誘導。
　　 我們首先構建了pFLAG-CMV8-CSP重組質粒,轉染DC后24h,熒光顯微鏡下觀察計算轉染效率,達到40％以上,然后,采用流式細胞儀檢測DC表面的CD80和MHC-Ⅱ類分子的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)轉染pFLAG-CMV8-CSP重組質粒與轉染pFLAG-CMV8空質粒對照組相比,CD80表達明顯上調,但是MHC-Ⅱ類分子的表達無明顯變化。說明進入胞漿內的CSP可以誘導DC成熟,但可能并非通過MHC-Ⅱ類分子介導的

8、途徑。
　　 本研究成功構建了約氏瘧原蟲子孢子與小鼠DC相互作用的體外研究平臺,這為進一步研究子孢子與DC的相互關系奠定了基礎。利用這個平臺研究發(fā)現(xiàn),子孢子可以侵入DC并在其胞內進行發(fā)育,并且侵入的子孢子能夠誘導DC的成熟。我們將pFLAG-CMV8-CSP重組質粒轉染DC后,發(fā)現(xiàn)子孢子同樣能夠誘導DC的成熟,說明侵入DC的子孢子CSP可以轉移至胞漿內誘導DC的成熟。這為更好地解釋DC與子孢子之間的相互關系,并進一步研究DC在瘧