約氏瘧原蟲藥物減毒子孢子疫苗誘導蟲期特異性免疫保護作用機制的研究.pdf

1、瘧疾是全球危害最為嚴重的三大傳染病之一。抗瘧藥耐藥性的日趨嚴重以及其他有限的瘧疾防止措施使瘧疾疫苗的研制工作變得更為迫切。紅前期是瘧原蟲感染人體的第一個時期，而且紅前期并不引起明顯的臨床癥狀，因而，紅前期是瘧疾疫苗研制最為理想的時期。瘧原蟲減毒子孢子疫苗可以誘導針對瘧疾紅前期的完全免疫保護。放射減毒子孢子(Radiation-attenuated sporozoite，RAS)的相關研究顯示，感染瘧原蟲的按蚊經(jīng)過放射減毒處理后通過叮咬的

2、方式免疫人體，大約1000個按蚊的叮咬可以誘導人體對瘧原蟲感染的完全保護作用。同時實驗證實，基于氯喹和其它抗瘧藥治療的藥物減毒子孢子疫苗(infection-treatment-vaccination，ITV)也能夠誘導小鼠或者人群對子孢子(sporozoite，SPZ)攻擊的完全保護，而且ITV的免疫方式所需要的SPZ量比RAS更少。有研究發(fā)現(xiàn)，基于氯喹(chloroquine，CQ)的ITV在通過15個感染按蚊的3次叮咬后可以介導人

3、體對瘧原蟲感染的完全保護作用。這說明ITV的免疫方式和RAS相比具有更強的抗原性。然而，目前ITV疫苗研究中所使用的大部分藥物如氯喹等因為全球范圍的抗藥性及副作用大等缺點阻礙了其應用于現(xiàn)場的可能。青蒿素聯(lián)合療法是目前治療瘧疾的一線用藥，青蒿素能更為迅速而且可以殺滅紅內期瘧原蟲的各個時期，雖然近幾年關于青蒿素耐藥性的報道逐漸增多，但是目前并無對青蒿素的完全耐藥即并無抗性株被分離鑒定。青蒿素及其衍生物與氯喹相似，均為通過殺死紅內期瘧原蟲來控

4、制瘧疾的癥狀，但是青蒿素及其衍生物與氯喹的殺蟲作用又有不盡相同之處:氯喹僅能殺傷滋養(yǎng)體期以后時期的瘧原蟲，而青蒿素及其衍生物卻可以殺傷全部紅內期的瘧原蟲，包括早期的環(huán)狀體。本研究首先驗證了青蒿素衍生物青蒿琥酯(artesunate，AS)作為ITV候選藥物的可能，然后比較氯喹及青蒿琥酯ITV兩種免疫方式所介導的免疫保護性的差異，深入研究了造成兩種藥物免疫保護差異性的機制。
　　本項目利用約氏瘧原蟲/小鼠感染模型，通過尾靜脈接種SP

5、Z后給予青蒿琥酯或者氯喹控制紅內期瘧原蟲的感染，免疫后給予SPZ或者感染紅細胞攻擊，驗證其保護性。發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯組小鼠僅對SPZ的攻擊有免疫，而氯喹組小鼠對SPZ及紅內期的攻擊均有免疫。然后，我們研究了青蒿琥酯及氯喹兩種不同藥物處理因素誘導產生免疫保護差異性的機制。利用ELISA和IFA試驗比較兩組小鼠抗體的差異性，并通過血清過繼轉移試驗及體外子孢子入侵試驗從功能上驗證血清在免疫保護性中發(fā)揮的作用。最后利用流式細胞分析技術檢測了肝臟及脾臟

6、淋巴細胞表型在免疫過程中的表達變化，并通過體外肝期瘧原蟲發(fā)育抑制試驗證實CD8+T細胞在紅前期保護性中的作用。具體的研究結果如下:
　　1、在第一次免疫過程中，氯喹組小鼠在給藥期間第4、5天出現(xiàn)可見的原蟲血癥，但是原蟲血癥比例在1％以下，第6天原蟲血癥消失。但是在停藥第4天后，原蟲血癥再次出現(xiàn)，并且提高CQ的給藥劑量，該現(xiàn)象仍然存在。但是高劑量的青蒿琥酯組卻能完全殺滅紅內期的感染。第一次免疫后11，14，18和24天通過RT-qP

7、CR檢測瘧原蟲18SrRNA的結果與血涂片檢測的結果相吻合。第二次免疫和第三免疫時氯喹組和青蒿琥酯組均未出現(xiàn)原蟲血癥，經(jīng)過3次免疫后，兩組小鼠均能產生針對約氏瘧原蟲SPZ攻擊的100％的免疫保護性，并且該保護性能持續(xù)至少6個月。而且，氯喹組不僅能夠誘發(fā)小鼠產生紅前期特異的保護作用，而且也能誘導一定的紅內期的保護作用，61.5％的小鼠在感染紅細胞攻擊后未出現(xiàn)原蟲血癥。但是，青蒿琥酯組小鼠僅對SPZ的攻擊有保護性。該現(xiàn)象說明青蒿琥酯組小鼠所

8、介導的保護性是紅前期特異的，而氯喹組小鼠不僅產生了對紅前期的免疫保護，對紅內期也產生了一定的免疫保護作用。
　　2、氯喹組及青蒿琥酯組小鼠抗紅內期特異抗體的表達存在很大的差異。IFA及ELISA的實驗證明青蒿琥酯組小鼠并未產生抗紅內期的抗體，而氯喹組不僅產生了紅內期特異的抗體，并且低劑量紅內期感染所介導的抗體反應足以對紅內期瘧原蟲起到殺傷作用。這就說明抗體在兩組免疫小鼠的保護性差異中發(fā)揮了重要的作用。
　　3、氯喹組及青蒿琥

9、酯組小鼠在免疫期間均表現(xiàn)出相似的肝臟CD8+Tem細胞的增殖，并且隨著免疫次數(shù)的增加而增加。在3次免疫后，青蒿琥酯組小鼠CD8+Tem細胞的比例與第一次免疫后相比約增加了1.8倍，氯喹組小鼠CD8+Tem細胞的比例與第一次免疫后相比約增加了1.4倍。同時CSP特異的CD8+Tem細胞的表達在攻擊前后增加了2.4-3.7倍，但是氯喹組和青蒿琥酯組之間并無明顯差異。說明CD8+Tem細胞在ITV免疫小鼠的紅前期免疫保護中發(fā)揮了重要的作用，但

10、是并不是介導兩組小鼠保護性差異的主要因素。
　　4、我們構建了體外實驗平臺，能夠定量的檢測CD8+T細胞對感染肝細胞的殺傷性的效應。在與500k CD8+T細胞共培養(yǎng)后，蚊唾液腺免疫對照組檢測到約34.9％的非特異性抑制作用，但是氯喹組及青蒿琥酯組均表現(xiàn)出大于80％的抑制作用。該平臺可以定量評價CD8+T細胞的功能，為以后高通量CD8+T細胞的功能研究提供重要的實驗平臺。
　　我們的研究結果證實了青蒿琥酯可以作為ITV免疫模

11、型的治療藥物，青蒿琥酯對紅內期瘧原蟲的殺傷性與瘧原蟲攻擊的數(shù)量及藥物的劑量相關，說明青蒿琥酯誘導的瘧原蟲期特異性的保護是藥物劑量依賴的。我們首次通過試驗證實氯喹治療的藥物減毒子孢子疫苗所介導的免疫保護性并不是紅前期特異的，免疫過程中低劑量的紅內期感染介導了其產生紅內期特異的免疫保護。兩種藥物ITV介導的免疫保護均是由抗體和T細胞所共同介導的，CD8+Tem是介導紅前期免疫保護作用的關鍵因素，而抗體也在這個過程中發(fā)揮了一定的作用?？贵w是介