干擾素誘導蛋白16對人主動脈外膜成纖維細胞增殖、遷移及凋亡的影響.pdf

1、目的：本文將觀察干擾素誘導蛋白16沉默和過表達對人主動脈外膜成纖維細胞（HAAFs）增殖、遷移及凋亡的影響，并探討其機制。
　　方法：1、沉默IFI16時，實驗分為3組：在HAAFs中轉染針對IFIl6基因的小分子干擾RNA(siRNA)作為IFI16基因沉默組（si-IFI16），轉染非特異性siRNA作為陰性對照組（NC），以及未經(jīng)處理的HAAFs組（Con）。2、IFI16過表達時，實驗分為3組：未經(jīng)處理的HAAFs組（Co

2、ntrol)、感染綠色熒光標記的control慢病毒組（Lv-GFP）、感染綠色熒光標記的 IFI16基因慢病毒組（Lv-IFI16-GFP）。3、通過轉染control siRNA（FITC conjugate）-A觀察HAAFs的轉染效率，通過感染攜帶熒光標記的慢病毒觀察HAAFs的感染效率。4、應用總RNA極速抽提試劑盒提取總RNA，RT-PCR試劑盒逆轉錄成cDNA，Real-Time PCR熒光染料試劑檢測細胞中IFI16 m

3、RNA的變化。5、收集對數(shù)生長期細胞，按約3000個細胞/孔接種于96孔板，通過CCK8試劑盒檢測HAAFs細胞活力情況，將CCK-8溶液加入到培養(yǎng)基中，在37℃含有5％CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標儀上測A450 nm處吸光值。6、應用流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期，收獲細胞，用PBS沖洗，重懸，按照PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I試劑盒檢測細胞凋亡，按照細胞周期及細胞凋亡試劑盒檢測細胞

4、周期。7、通過細胞劃痕實驗和Transwell遷移實驗觀察細胞遷移情況。8、通過Western blot檢測細胞中IFI16、ERK1/2、p-ERK1/2、p53、p21、Bax及Bcl-2蛋白表達。首先應用12%膠的分離蛋白并轉移到PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1h，加入一抗工作液，4℃過夜，然后是室溫下孵育二抗工作液1 h，應用ECL發(fā)光。
　　結果：1、與Con組和NC組比較，si-IFI16組的IFI

5、16 mRNA和蛋白水平明顯下調，p53、p21、Bax及Bax/Bcl-2的蛋白表達減少，同時Bcl-2的蛋白表達和ERK1/2的磷酸化水平增高。通過抑制細胞內源性IFI16的表達，HAAFs細胞活力增強，增加了細胞周期G1/S的轉換，細胞的遷移距離和數(shù)量增加，細胞凋亡減少。2、與Control組和Lv-GFP組比較，Lv-IFI16-GFP組的IFI16 mRNA的上調以及IFI16、p53和p21蛋白表達增加，HAAFs細胞活力減