干擾cAMP表達(dá)對TNF-α致鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：通過體外實(shí)驗(yàn)探討腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)誘導(dǎo)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為設(shè)計(jì)治療塵肺新藥提供參科學(xué)的參考依據(jù)。
　　 方法：對SD大乳鼠肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，傳至4-5代后，用無血清Eagles液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，進(jìn)行純化培養(yǎng)和刺激培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為6組：空白對照組：加入無血清Eagles液；TNF-α組：含20ng/mlTNF-α的無血清的Eagles液；FSK組：含10-6

2、mol/LFSK的無血清的Eagles液；20ng/mlTNF-α+10-7mol/LFSK組；20ng/mlTNF-α+10-6mol/LFSK組；20ng/ml TNF-α+10-5mol/LFSK組，每組設(shè)4瓶平行樣品。置37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)刺激培養(yǎng)4h和24h。用氯氨T法檢測鼠肺成纖維細(xì)胞中羥脯氨酸的含量；用Western blot技術(shù)檢測鼠肺成纖維細(xì)胞Gq蛋白的表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測鼠肺成纖維細(xì)胞

3、內(nèi)環(huán)-磷酸腺苷(cAMP)的含量；用熒光細(xì)胞免疫組化技術(shù)測定鼠肺成纖維細(xì)胞內(nèi)磷脂酶C(PLC)和蛋白激酶C(PKC)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.羥脯氨酸含量結(jié)果顯示：在同一時(shí)間點(diǎn)，單獨(dú)TNF-α和TNF-α聯(lián)合FSK組羥脯氨酸含量較空白對照組高；TNF-α聯(lián)合FSK組的羥脯氨酸含量較單獨(dú)TNF-α組低，且隨著FSK濃度的增高，各實(shí)驗(yàn)組羥脯氨酸含量逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組隨著作用時(shí)間的延長，羥脯氨酸含量顯著

4、升高(P＜0.05)。2.cAMP含量結(jié)果顯示：在同一時(shí)間點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組cAMP表達(dá)量較空白對照組顯著增高；TNF-α+10-5mol/LFSK組cAMP表達(dá)量較其它實(shí)驗(yàn)組高；單獨(dú)TNF-α組的cAMP表達(dá)含量較單獨(dú)FSK組和TNF-α+10-6mol/LFSK組高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在4h時(shí)間點(diǎn)，TNF-α+10-7mol/LFSK組的cAMP表達(dá)量較單獨(dú)FSK和TNF-α+10-6mol/LFSK組高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義(P＜0.05)。3.Gq蛋白Western blot結(jié)果顯示：在同一時(shí)間點(diǎn)，單獨(dú)TNF-α組，TNF-α聯(lián)合不同濃度FSK組的Gq蛋白表達(dá)量較空白對照組高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TNF-α聯(lián)合不同濃度FSK組與TNF-α組Gq蛋白表達(dá)量兩兩比較，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)不同時(shí)間點(diǎn)間結(jié)果比較顯示：20ng/ml TNF-α和20ng/ml TNF-α聯(lián)合不同濃度FSK組的Gq蛋白表達(dá)量較4h時(shí)間點(diǎn)低，差別

6、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4.PLC結(jié)果顯示：在4h時(shí)間點(diǎn)，所有實(shí)驗(yàn)組的PLC平均光密度值較空白對照組高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在24h時(shí)間點(diǎn)，單獨(dú)TNF-α組和TNF-α+10-7mol/LFSK組PLC平均光密度值較空白對照組高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在同一時(shí)間點(diǎn)，TNF-α聯(lián)合l0-6mol/L和10-5mol/LFSK組PLC平均光密度值較單獨(dú)TNF-α組低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，

7、且隨著FSK濃度的增高和作用時(shí)間的延長PLC平均光密度值逐漸降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5.PKC結(jié)果顯示：在同一時(shí)間點(diǎn)，單獨(dú)FSK組，單獨(dú)TNF-α組，TNF-α聯(lián)合l0-7mol/L和10-6mol/LFSK組的PLC平均光密度值較空白對照組高；TNF-α聯(lián)合10-6mol/L和10-5mol/LFSK組的PKC平均光密度值較單獨(dú)TNF-α組低差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；并且伴隨FSK濃度的增高，逐漸降低，差別

8、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1、TNF-α可能通過活化Gq-PLC-PKC途徑促進(jìn)鼠肺成纖維細(xì)胞的增殖。2、TNF-α可以上調(diào)鼠肺成纖維細(xì)胞Gq蛋白水平，提高cAMP水平對這種上調(diào)作用影響不明顯。3、FSK對TNF-α引起的鼠肺成纖維細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，并且這種抑制作用呈現(xiàn)一定劑量依賴關(guān)系。4、在TNF-α作用鼠肺成纖維細(xì)胞時(shí)，上調(diào)cAMP水平可能會(huì)干擾Gq-PLC-PKC通路下游信號分子PLC、PKC而