Sunitinib經(jīng)STAT3通路抑制LPS誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)PD-L1的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究分子靶向藥物舒尼替尼（sunitinib）對(duì)腎癌患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）表面表達(dá)的共抑制分子程序性死亡蛋白配體1（PD-L1）、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4及皰疹病毒侵入介體（HVEM）表達(dá)的影響以及探討sunitinib是否經(jīng)過(guò)STAT3信號(hào)通路調(diào)控DC表面共抑制分子的表達(dá)變化，為sunitinib聯(lián)合DC免疫治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　體外誘導(dǎo)培養(yǎng)腎癌患

2、者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的 DC,隨機(jī)分為 sunitinib聯(lián)合 LPS組、LPS組、STAT3通路特異性阻斷劑JSI-124聯(lián)合LPS組及DMSO組。Sunitinib聯(lián)合LPS組用200 ng/mL sunitinib預(yù)處理DC12 h，再用1μg/mL脂多糖（LPS）刺激24h；LPS組用1μL/mL DMSO預(yù)處理12h，再用1μg/mL LPS刺激24h；JSI-124聯(lián)合LPS組用500 nmol/mL JSI-124預(yù)處理1

3、2h，再用1μg/mL脂多糖（LPS）刺激24h；DMSO組用1μL/mL DMSO作用36h。倒置顯微鏡觀察各組形態(tài)變化；臺(tái)酚藍(lán)染色法檢測(cè)各組 DC活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組 DC表型 HLA-DR、CD83及 CCR7表達(dá)變化和DC表面共抑制分子PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4及HVEM表達(dá)水平；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Westren blot）檢測(cè)各組STAT3蛋白及磷酸化-STAT3蛋白（p-STAT3）的變化。應(yīng)用S

4、PSS19.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，方差齊性檢驗(yàn)（Levene檢驗(yàn)）后，進(jìn)行兩樣本 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，可見(jiàn)各組貼壁細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，逐漸增大，細(xì)胞逐漸呈半懸浮狀態(tài)，細(xì)胞體積變大，形狀不規(guī)則，表面突起明顯。經(jīng)LPS誘導(dǎo)24h后，sunitinib聯(lián)合LPS組和LPS組的細(xì)胞顯著增大，毛刺狀更明顯，表現(xiàn)為典型的“樹(shù)枝狀”

5、形態(tài)，而JSI-124組聯(lián)合LPS組的細(xì)胞顯著變大變圓，毛刺狀不明顯，且細(xì)胞均呈懸浮狀態(tài)。另外，DMSO組的DC形態(tài)變化不明顯。
　　2.通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)各組 DC活性，根據(jù)公式：活細(xì)胞率（％）=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100％，計(jì)算得出，與LPS組相比，各組活細(xì)胞率均無(wú)明顯差異。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究DC的百分比為79.92%，獲得了較高純度的DC；各組DC表型CCR7、CD83、HLA-D

6、R分析：與LPS組相比，sunitinib聯(lián)合LPS組和DMSO組的CCR7百分比顯著減低（P＜0.01）;sunitinib聯(lián)合LPS組的CD83百分比高于LPS組，而LPS組明顯高于DMSO組（P＜0.01）；另外，在各組表達(dá)HLA-DR的平均熒光強(qiáng)度中，sunitinib聯(lián)合LPS組和 JSI-124聯(lián)合LPS組均無(wú)顯著差異，而DMSO組明顯低表達(dá)（P＜0.01）。各組DC共抑制分子分析：相比較LPS組，sunitinib聯(lián)合LP

7、S組表達(dá)的B7-H4百分比和PD-L1、CD80平均熒光強(qiáng)度均顯著減低（P＜0.01,P＜0.05，P＜0.01），而PD-L2、CD86及HVEM平均熒光強(qiáng)度卻無(wú)明顯差別；JSI-124聯(lián)合LPS組表達(dá)PD-L1的平均熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05），CD80、CD86、PD-L2、B7-H4及HVEM無(wú)顯著差異；DMSO組的各共抑制分子 PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4及 HVEM均呈低水平表達(dá)（P＜0.01）。<

8、br>　　4. sunitinib聯(lián)合LPS組、JSI-124聯(lián)合LPS組及DMSO組的p-STAT3蛋白灰度比分別為1.24±0.11、0.51±0.1、0.02±0.004均低于LPS組2.1±0.3，而STAT3蛋白灰度比無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1. LPS誘導(dǎo)腎癌患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的 DC快速成熟，sunitinib不影響 DC的形態(tài)變化。
　　2. LPS促進(jìn)DC表達(dá)抑制性信號(hào)，而sunitinib