正五聚蛋白-3在膠質(zhì)瘤中的表達以及對生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、前言：
　　膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)外胚層，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見，同時預(yù)后也最差。據(jù)報道，在20歲至59歲的年齡段，每年我國原發(fā)性腦腫瘤的發(fā)病率為0.022‰，其中膠質(zhì)瘤占31.1％。大多數(shù)膠質(zhì)瘤起源于不同類型的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，但由于組織發(fā)生來源及生物學(xué)特征類似，一般統(tǒng)稱為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。其中彌漫型和間變型星形細胞瘤占25.2％;少突星形細胞瘤，少突膠質(zhì)細胞瘤及間變型少突膠質(zhì)細胞瘤占18％;膠質(zhì)母細胞瘤占3

2、0％;其余類型較為罕見如間變型室管膜瘤和間變型神經(jīng)節(jié)細胞膠質(zhì)瘤。由于大部分膠質(zhì)瘤為浸潤性、彌漫性生長，與周邊正常腦組織邊界不清且容易復(fù)發(fā)，故患者治愈率低，預(yù)后差。盡管目前對人體惡性腫瘤的綜合治療取得了突飛猛進的發(fā)展，但是對膠質(zhì)瘤，尤其是多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)而言，尚且沒有根本的治療方法。因此研究膠質(zhì)瘤中侵襲相關(guān)基因和作用機制，可以指導(dǎo)臨床制定膠質(zhì)瘤患者的個性化治療方案并有助于判斷預(yù)后

3、，為膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)治療提供相對理想的靶點。
　　正五聚蛋白-3(Pentraxin3，PTX3)也被稱作腫瘤壞死因子誘導(dǎo)性基因14蛋白(TSG-14)，基因位于染色體3(q24-28)，是五聚蛋白家族(PTXs)成員之一，作為一種炎癥因子被深入研究。近幾年，對于PTX3在腫瘤學(xué)機制方面的探索正逐步深入，國外已有學(xué)者報道，PTX3在人肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脂肪肉瘤等惡性腫瘤中高度表達，并且和腫瘤細胞的侵襲性相關(guān)。然而，

4、PTX3對人膠質(zhì)瘤細胞增殖，遷移及侵襲能力等生物學(xué)特性的影響尚不清楚。
　　目前研究腫瘤侵襲的常用方法為Transwell侵襲實驗，一定時間內(nèi)，通過統(tǒng)計穿過基質(zhì)膠的腫瘤細胞的數(shù)量來評估侵襲能力，但是由于人工提取的基質(zhì)膠并不能提供在體的組織結(jié)構(gòu)和細胞周圍微環(huán)境，此實驗方法具有一定的局限性。近來膠質(zhì)瘤細胞-器官型腦片共培養(yǎng)模型作為研究膠質(zhì)瘤侵襲的手段開始受到關(guān)注，然而由于技術(shù)等原因在國內(nèi)這方面的研究還很少。
　　本研究首先檢測P

5、TX3在膠質(zhì)瘤中的表達水平，并通過轉(zhuǎn)染PTX3特異性的siRNA來降低PTX3的表達，分析其對U87MG細胞增殖、遷移能力的影響。然后建立膠質(zhì)瘤細胞-器官型腦片共培養(yǎng)模型，對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力進行檢測。
　　目的：
　　1.通過檢測PTX3在人腦不同惡性程度膠質(zhì)瘤中的表達情況，分析其表達水平與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系。
　　2.通過設(shè)計合成PTX3特異性的siRNA，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U87MG細胞從而下調(diào)PTX3在膠質(zhì)瘤細胞中

6、的表達，檢測膠質(zhì)瘤U87MG細胞增殖，遷移能力的變化，探討PTX3對膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的作用。
　　3.建立膠質(zhì)瘤細胞-腦片共培養(yǎng)模型，通過激光共聚焦顯微鏡觀察U87MG細胞在共培養(yǎng)模型上的侵襲程度，用更完善的體外模型探討PTX3對膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響，并通過檢測侵襲相關(guān)基因的表達變化闡明PTX3影響膠質(zhì)瘤侵襲性的可能機制。
　　方法：
　　1.收集2014年至2015年，在我院神經(jīng)外科手術(shù)切除，并經(jīng)病理診斷證實的6

7、0例人腦膠質(zhì)瘤標本，以10例瘤周組織作為對照組織。按照2007年WHO膠質(zhì)瘤分級，將膠質(zhì)瘤組織標本分為低級別膠質(zhì)瘤組（WHOⅠ～Ⅱ級）和高級別膠質(zhì)瘤組（WHOⅢ～Ⅳ級），用Real-time RT-PCR、免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)分別檢測PTX3的mRNA和蛋白在不同級別膠質(zhì)瘤組織及對照組織中的表達情況。
　　2.設(shè)計合成PTX3靶向小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，以脂質(zhì)體

8、為介質(zhì)轉(zhuǎn)染至U87MG細胞，應(yīng)用Real-time RT-PCR技術(shù)和Western blot分別檢測PTX3在mRNA和蛋白表達水平的變化，并判斷siRNA的干擾效果，選擇干擾效果顯著者進行后續(xù)試驗;進一步用MTT增殖實驗檢測siRNA對U87MG細胞增殖能力的影響;通過劃痕實驗檢測siRNA對U87MG細胞遷移能力的影響;利用流式細胞技術(shù)分析siRNA對U87MG細胞凋亡的影響。
　　3.建立U87MG細胞-腦片共培養(yǎng)模型，用

9、Dio綠色熒光染劑將U87MG細胞染色，經(jīng)過成球培養(yǎng)后，選取半徑為100μm的膠質(zhì)瘤細胞球接種至腦片上。培養(yǎng)后第5天，用激光共聚焦顯微鏡檢測腦片內(nèi)各層膠質(zhì)瘤細胞球的熒光強度，對比siRNA組及對照組膠質(zhì)瘤細胞球在腦片上的侵襲深度，進而分析PTX3對膠質(zhì)瘤侵襲能力的影響。同時通過Matrigel侵襲實驗檢測PTX3對U87MG細胞侵襲的影響，同器官型腦片模型的侵襲實驗結(jié)果進行對比。應(yīng)用Western blot檢測PTX3沉默后對MMP-1

10、，MMP-2，MMP-9，uPA侵襲相關(guān)蛋白表達的影響。
　　4.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包，計量資料以均數(shù)±標準差((x)±SD)表示，對數(shù)據(jù)用單因素方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，設(shè)置P＜0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.PTX3的mRNA和蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達及其與病理級別的關(guān)系
　　PTX3的mRNA和蛋白在膠質(zhì)瘤及對照組織中均有表達，但在膠質(zhì)瘤中的表達水平顯著增高(P＜0.05)

11、，在高級別膠質(zhì)瘤組中的表達亦明顯高于其在低級別膠質(zhì)瘤組(P＜0.05)。PTX3的mRNA在兩組膠質(zhì)瘤中相對表達量分別為(4.02±0.313)和(3.15±0.208)，高級別組和低級別組進行比較，差異顯著并均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot法檢測PTX3蛋白在對照組、低級別膠質(zhì)瘤組和高級別膠質(zhì)瘤組的相對表達量分別為(0.135±0.031)、(0.251±0.059)和(0.572±0.063)。膠質(zhì)瘤組和對照

12、組之間進行比較，差異顯著并有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.RNA干擾及其對U87MG細胞增殖和遷移的影響
　　Real-time RT-PCR和Western blot的實驗結(jié)果證實成功轉(zhuǎn)染siRNA至膠質(zhì)瘤 U87MG細胞中，siRNA轉(zhuǎn)染細胞48h后，PTX3的mRNA表達水平分別下降了56.2％和22.3％，其中以siRNA-1組轉(zhuǎn)染率最高，選擇其進行后續(xù)實驗;MTT增殖實驗結(jié)果顯示，siRNA下調(diào)PTX3表達

13、后，U87MG細胞在體外增殖能力減弱。劃痕實驗結(jié)果顯示，siRNA下調(diào)PTX3表達后，U87MG細胞在體外遷移能力減弱，數(shù)據(jù)結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.建立U87MG細胞-腦片共培養(yǎng)模型以及侵襲研究
　　經(jīng)鏡下觀察及碘化丙啶染色檢測神經(jīng)細胞死亡程度，選取活性良好的腦片進行侵襲實驗，通過激光共聚焦掃描顯微鏡從腦片表面(0μm)處向下，以每5μm為單位逐層掃描至組織深部(100μm)，最后選取0μm，20μm，

14、40μm，60μm，80μm，100μm，6個層面進行圖像采集。結(jié)果顯示對照組中各層皆有熒光信號，100μm層面熒光信號微弱，提示有少量腫瘤細胞浸潤;siRNA-1組在腦片表面以下60μm的層面，膠質(zhì)瘤細胞球的大小及熒光強度均小于對照組，且在100μm的層面未檢測到綠色熒光信號，提示沒有膠質(zhì)瘤細胞浸潤，膠質(zhì)瘤細胞球的侵襲深度小于對照組，數(shù)據(jù)結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，siRNA下調(diào)PTX3表達后

15、，U87MG細胞的體外侵襲能力減弱。Western blot結(jié)果顯示在U87MG細胞中，減低PTX3表達后引起MMP-1，MMP-2的表達明顯下調(diào)，而MMP-9和uPA表達無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1、PTX3在人腦膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，其表達水平隨膠質(zhì)瘤惡性程度增高而增高。
　　2、PTX3促進膠質(zhì)瘤U87MG細胞的增殖和遷移能力，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。
　　3、基于器官型腦片模型，PTX3促