小鼠精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)與移植的初步研究.pdf

1、目的：通過比較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與慢病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠精原干細(xì)胞，確立適宜小鼠精原干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)基因操作方法，獲得GFP-陽(yáng)性精原干細(xì)胞后通過睪丸輸出小管顯微注射法進(jìn)行小鼠精原干細(xì)胞移植，以期觀察GFP陽(yáng)性小鼠精原干細(xì)胞在受體小鼠睪丸中的存活情況。
　　 方法：利用本所已建立的ICR品系新生小鼠精原干細(xì)胞系，比較了脂質(zhì)體介導(dǎo)法和慢病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞的效率。確立了適宜的方法，即通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV、pM

2、D.G共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，制備慢病毒(Lentivirus-GFP)，檢測(cè)病毒滴度。通過慢病毒將帶有綠色熒光蛋白(GFP）標(biāo)記的病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠精原干細(xì)胞內(nèi)，使其發(fā)出綠色熒光。收集GFP陽(yáng)性精原干細(xì)胞后進(jìn)行體外培養(yǎng)與擴(kuò)增，于移植前消化成單細(xì)胞懸液，經(jīng)睪丸輸出小管顯微注射技術(shù)，對(duì)白消安腹腔注射處理的不育小鼠行同種異體移植，觀察GFP陽(yáng)性精原干細(xì)胞在受體小鼠睪丸內(nèi)的存活情況。
　　 結(jié)果：慢病毒可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠精原干細(xì)胞，較普

3、通脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法獲得更多GFP陽(yáng)性細(xì)胞。移植術(shù)后30天熒光解剖顯微鏡下可見睪丸組織有散在光點(diǎn)，但未見曲細(xì)精管發(fā)出明顯綠色熒光，睪丸組織冰凍切片內(nèi)可見少量綠色熒光蛋白表達(dá)陽(yáng)性的精原干細(xì)胞沿著曲細(xì)精管基底膜生長(zhǎng)增殖。
　　 結(jié)論：
　　 1、證實(shí)了慢病毒介導(dǎo)法是一種適宜小鼠精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。
　　 2、建立了白消安腹腔注射法不育受體小鼠模型。
　　 3、成功運(yùn)用輸出小管顯微注射技術(shù)完成精原干細(xì)胞移植。