BDNF對不同初級傳入神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2的調(diào)控機制研究.pdf

1、谷氨酸轉(zhuǎn)運體(vesicular glutamate transporters，VGLUTs)存在于囊泡膜上，能夠?qū)⑸窠?jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運至突觸囊泡內(nèi)，并由此將神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸釋放到突觸間隙而產(chǎn)生突觸后效應(yīng)。VGLUTs通過依賴氫離子濃度梯度來進行神經(jīng)遞質(zhì)的攝取與釋放。到目前為止，共有VGLUT1-3三種主要類型的轉(zhuǎn)運體被發(fā)現(xiàn)，而第三種轉(zhuǎn)運體VGLUT3分布相對局限，而且對其功能知之甚少。表達于神經(jīng)元的VGLUT3經(jīng)典的轉(zhuǎn)運機制是與其他神經(jīng)遞質(zhì)，如

2、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）一同進行協(xié)同轉(zhuǎn)運，而VGLUT3在5-羥色胺能神經(jīng)元所促成的谷氨酸信號可促進5-HT的信息傳遞。單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT向突觸囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運和由突觸前膜的釋放，有賴于囊泡單胺能轉(zhuǎn)運體2(vesicular monoamine transporter2，VMAT2)的正常表達和運轉(zhuǎn)。VGLUT3和VMAT2在同一個神經(jīng)元內(nèi)的共存現(xiàn)象進一步揭示了不同神經(jīng)遞質(zhì)協(xié)同轉(zhuǎn)運的機制。作為將周圍的

3、軀體感覺和內(nèi)臟感覺信息向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)傳遞的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)初級傳入神經(jīng)元和將聽覺信息向CNS傳遞的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiralganglion neuron，SGN)，在處理不同的信息傳遞過程中均有賴于神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運、儲存和釋放，而這一系列的過程又有賴于轉(zhuǎn)運體的正常表達和運轉(zhuǎn)，而VGLUT3和VMAT2在DRG和SGN初級傳入神經(jīng)元的

4、表達以及調(diào)節(jié)機制仍不完全明確。
　　作為神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophin，NT)家族的重要成員之一，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervoussystem，PNS)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。BDNF發(fā)揮生物學(xué)作用的過程是通過與其特異的高親和力酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，Trk

5、B)結(jié)合，進而激活其下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)和磷脂酶Cγ(phospholipase C gamma，PLCγ)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但是，BDNF是否對DRG和SGN初級傳入神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2的表達具有影響作用，目前尚不明確， BDNF對于神經(jīng)元的突起生長與轉(zhuǎn)運

6、體表達調(diào)控之間的關(guān)系尚需要進一步研究。
　　基于以上研究背景，本課題分別應(yīng)用原代培養(yǎng)DRG和SGN神經(jīng)元，研究外源性BDNF對轉(zhuǎn)運體VGLUT3和VMAT2的表達調(diào)控作用及其機制，探討B(tài)DNF對VGLUT3和VMAT2的表達調(diào)控中細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularsignal-regulated protein kinase1/2，ERK1/2)、PI3K/Akt和PLCγ三種信號通路所參與的作用，并進一步用

7、用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）進行VGLUT3和VMAT2的干擾實驗來探究VGLUT3和VMAT2在BDNF引起的神經(jīng)突起生長過程中的作用機制;為進一步確定轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5在促進神經(jīng)元生長中的確切機制，本課題通過siRNA干擾實驗干擾Etv4和Etv5的表達或構(gòu)建Etv4和Etv5過表達載體并轉(zhuǎn)染DRG神經(jīng)元使Etv4和Etv5過表達，來明確其在BDNF信號調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元突起的生長過

8、程中所發(fā)揮的作用。
　　第一部分BDNF對DRG神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2表達的調(diào)控作用
　　本課題利用原代培養(yǎng)的DRG初級傳入神經(jīng)元，研究了BDNF及其相應(yīng)的細胞信號傳導(dǎo)通路參與VGLUT3和VMAT2表達的調(diào)控作用，以及這種調(diào)控機制與神經(jīng)元的突起生長之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，BDNF促進DRG神經(jīng)元的突起生長和生長相關(guān)蛋白43（growth-associated protein43，GAP-43）的表達呈劑量依賴效應(yīng)。而

9、且，BDNF能夠上調(diào)轉(zhuǎn)運體VGLUT3的表達，很可能是通過激活下游PLCγ信號通路起作用的。雖然BDNF沒有能夠上調(diào)VMAT2的表達，但是在DRG神經(jīng)元中，在外源性BDNF作用下通過抑制PI3K或PLCγ信號通路可以抑制VMAT2的表達，這一結(jié)果顯示，BDNF對VMAT2表達的調(diào)控作用不如對VGLUT3表達的調(diào)控作用明顯，但BDNF下游的相關(guān)細胞信號通路也可能介導(dǎo)了VMAT2的表達。通過siRNA干擾VGLUT3和VMAT2的表達后，B

10、DNF對突起生長的促進作用和GAP-43的表達上調(diào)并沒有受到顯著影響，BDNF對VGLUT3表達的獨特作用闡釋了在DRG初級傳入神經(jīng)元中外源性BDNF對谷氨酸信號傳入的調(diào)控可能存在不同的機制。BDNF引起的VGLUT3表達上調(diào)可能是BDNF調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的一個重要機制。BDNF信號在初級傳入神經(jīng)元中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運體所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，對于解釋BDNF介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的作用機制增添了新的研究內(nèi)容。
　　第二部分BDNF通過激活轉(zhuǎn)

11、錄因子Etv4和Etv5促進轉(zhuǎn)運體VGLUT3的表達和DRG神經(jīng)元的生長
　　本課題設(shè)計了以檢測和影響轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5表達為主線的實驗，探討了BDNF及其相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對Etv4和Etv5表達的影響作用，通過特異性的siRNA干擾Etv4和Etv5的表達、通過轉(zhuǎn)染Etv4和Etv5過表達載體使Etv4和Etv5的表達水平上調(diào)的實驗條件下，BDNF及其相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對生長相關(guān)蛋白GAP-43以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋

12、白中分子量神經(jīng)絲蛋白(mediumneurofilament，NF-M)和輕分子量神經(jīng)絲蛋白(light neurofilament, NF-L)表達變化的影響，進而分析在這種特有的實驗條件下DRG神經(jīng)元突起生長或再生的機制，并在siRNA干擾Etv4和Etv5表達的條件下，在BDNF存在時VGLUT3和VMAT2的表達變化，試圖闡明轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5所介導(dǎo)的、在BDNF存在時，DRG神經(jīng)元突起生長或再生的機制及其與VGLUT3

13、和VMAT2表達之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，外源性BDNF孵育可顯著上調(diào)Etv4和Etv5及其mRNA的表達水平，BDNF上調(diào)Etv4和Etv5表達的效應(yīng)可能是通過激活其下游的ERK1/2信號通路而實現(xiàn)的;Etv4 siRNA或Etv5 siRNA可使BDNF孵育狀態(tài)下，生長相關(guān)蛋白GAP-43以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白NF-M、NF-L的表達水平下調(diào)，這與在同樣實驗條件下DRG神經(jīng)元突起的縮短是一致的;過表達Etv4或Etv5可使BDNF孵育狀態(tài)下

14、，生長相關(guān)蛋白GAP-43以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白NF-M、NF-L的表達水平上調(diào)，這與在同樣實驗條件下DRG神經(jīng)元突起的延長是一致的;Etv4 siRNA或Etv5 siRNA可阻止BDNF孵育狀態(tài)下VGLUT3表達上調(diào)的趨勢，而對VMAT2表達的影響作用不明顯。以上結(jié)果表明，BDNF可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5的表達而誘發(fā)生長相關(guān)蛋白GAP-43的表達，并啟動神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白NF-M、NF-L的表達，在DRG神經(jīng)元突起生長或再生過程

15、中發(fā)揮重要的作用，這可能是DRG神經(jīng)元突起生長并發(fā)育成熟的重要機制;BDNF還可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5的表達而使VGLUT3表達上調(diào)，這可能是BDNF上調(diào)VGLUT3表達而增強興奮性氨基酸谷氨酸信息傳遞效能的重要機制之一，這與BDNF所介導(dǎo)的機械性痛覺信息傳遞或機械性痛覺過敏的作用是一致的。Etv4和Etv5作為初級傳入神經(jīng)元BDNF及其受體信號系統(tǒng)調(diào)控神經(jīng)元突起生長以及上調(diào)轉(zhuǎn)運體VGLUT3表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元突起

16、生長或再生中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用以及對轉(zhuǎn)運體VGLUT3表達的調(diào)控所產(chǎn)生的重要作用，不僅對于揭示以BDNF及其受體信號系統(tǒng)為主導(dǎo)的促神經(jīng)元突起生長的機制增添了新的實驗依據(jù)，而且對于其在以調(diào)控轉(zhuǎn)運體VGLUT3表達為關(guān)鍵步驟的增強谷氨酸信號傳遞的機制方面提供了新的理論基礎(chǔ)。
　　第三部分BDNF對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2的調(diào)控作用
　　本課題應(yīng)用原代培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neuro

17、n，SGN)，研究外源性BDNF對于初級傳入SGN轉(zhuǎn)運體VGLUT3和VMAT2表達的可能調(diào)控作用及其可能的機制，并探究這種調(diào)控機制與SGN存活和突起生長的關(guān)系。結(jié)果顯示，外源性BDNF不僅可以通過激活其下游的PI3K/Akt信號通路發(fā)揮對SGN中VGLUT3表達上調(diào)的作用，而且對SGN神經(jīng)元突起的生長和SGN神經(jīng)元存活具有促進作用;在本實驗的特定條件下，外源性BDNF尚不能調(diào)控SGN中的單胺類轉(zhuǎn)運體VMAT2的表達;BDNF促進SGN