大鼠痢疾桿菌感染后PAR-2-AP誘發(fā)的結(jié)腸舒張和腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變及其機制研究.pdf

1、第一部分:大鼠腸道痢疾桿菌感染對PAR-2-AP舒張結(jié)腸平滑肌作用的影響及其機制
　　 目的：PAR-2(Protease-Activated Receptor2)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族,廣泛分布于消化道,參與調(diào)控消化道的運動、分泌和炎癥反應。在腸道急性炎癥期,PAR-2激動劑抑制大鼠遠端結(jié)腸運動的作用減弱,但炎癥后PAR-2激動劑的這種作用是否恢復到正常還不清楚。在制作腸道感染和炎癥模型時大多數(shù)實驗室都采用化學物質(zhì)刺激或是寄

2、生蟲感染的方法,而最與臨床接近的大鼠腸道細菌感染模型鮮見報道。因此,本研究采用了胃內(nèi)灌注痢疾桿菌的方式制作大鼠腸道感染模型,探討了腸道感染后不同時間點PAR-2舒張結(jié)腸平滑肌作用的改變及其機制。
　　 方法：細菌準備弗氏志賀痢疾桿菌(Shigella flexneri)由山東大學齊魯醫(yī)院檢驗科提供。
　　 腸炎模型建立：健康雄性Wistar大鼠(200-220 g),隨機分為對照組和痢疾桿菌感染組(SF-treated)

3、。實驗前禁食,自由飲水。對照組給予高壓處理的生理鹽水1 ml灌胃,感染組給予1×108 CFU ml-1痢疾桿菌菌液1 ml灌胃。觀察大鼠腸道感染后大便性狀的改變、進食及體重增長情況,并分別于灌胃后第4天、第7天、第11天、第18天、第25天和第35天斷頭處死動物,取遠端結(jié)腸做石蠟切片,HE染色。取遠端結(jié)腸組織做MPO測定、肌條張力測定及Western blot檢測。
　　 髓過氧化物酶活性測定：遠端結(jié)腸組織勻漿后,利用MPO測

4、定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測結(jié)腸全層組織中MPO活性。HE染色：4％多聚甲醛固定新鮮結(jié)腸標本,石蠟包埋,切片厚4μm。常規(guī)脫蠟,水化。蘇木素染色,水洗后鹽酸酒精分化,氨水返藍,伊紅染色,脫水,透明,中性樹膠封片。結(jié)腸離體肌條張力記錄：
　　 肌條制備：斷頭處死大鼠,快速取出2-3 cm遠端結(jié)腸(距直腸1 cm)置于預冷的Krebs液中。沿腸系膜剪開腸腔,小心清理腸腔。沿肌纖維走向取結(jié)腸組織,制作縱行肌條和環(huán)形肌條(4m

5、m×10mm)。將肌條分別置于盛有5 ml Krebs液的玻璃浴槽內(nèi),持續(xù)供給95％ O2和5％ CO2并恒溫37℃,每15 min更換一次Krebs液。待肌條自發(fā)收縮穩(wěn)定以后開始實驗。
　　 實驗步驟：加入50μl不同濃度的PAR-2激動肽段(PAR-2 activatingpeptide,PAR-2-AP)或無活性的PAR-2反向肽段(PAR-2 reverse peptide,PAR-2-RP),使終濃度為1-10μM,觀

6、察PAR-2激活后結(jié)腸肌條自發(fā)收縮活動的改變。觀察阻斷劑TTX的作用時,先加入50μl TTX溶液使終濃度為10μM孵育30 min,再加入不同濃度的PAR-2-AP或PAR-2-RP。
　　 免疫組織化學：端結(jié)腸冰凍切片用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,3％過氧化氫封閉10 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗,5％正常兔血清封閉15 min后,滴加羊多克隆抗PAR-2抗體(1:50,50μl)后4℃環(huán)境中孵育過夜,然后用PBS沖洗

7、,加入辣根酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的抗山羊IgG工作液后室溫孵育30 min,用DAB顯色,蘇木素復染,鹽酸酒精分化,氨水返藍,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。
　　 Western blot：將結(jié)腸組織勻漿后,4℃離心,取上清液進行蛋白定量。與sample buffer按照1:1比例混勻,煮沸5 min使蛋白變性。10％SDS-PAGE(sodium dodecylsulfatep

8、olyacrylamide gel)電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫下5％脫脂奶粉封閉90 min,加入PAR-2-抗(sc-8205,1:2000)4℃孵育過夜。用TTBS沖洗3次,每次5 min后,在室溫下加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:80000)孵育1hr,用TTBS沖洗3次后,ECL顯影。
　　 統(tǒng)計分析：在離體肌條實驗中,以肌條的平均張力為觀察指標,加PAR-2-AP或PAR-2-RP之前3 min的平均張力為基礎(chǔ)值,標準化為10

9、0％,加入PAR-2-AP或PAR-2-RP之后不同時間點的平均張力為效應值,效應值與基礎(chǔ)值的比值為統(tǒng)計指標。
　　 在western bolt實驗中,對照組目的蛋白的灰度值標準化為100％,痢疾桿菌處理組目的蛋白的灰度值與對照組目的蛋白的灰度值之比為統(tǒng)計指標。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示,采用單因素方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學處理,以P<0.05為顯著性差異界值。
　　 結(jié)果：
　　 1.大

10、鼠在痢疾桿菌(1×108 CFU/ml,1 ml)灌胃后第3-4天陸續(xù)開始出現(xiàn)腹瀉、稀便,在7-11天最嚴重,第18天后消失。HE染色顯示在第4天-11天粘膜水腫,粘膜下中性粒細胞浸潤。與對照組相比,感染組大鼠體重增長只在第11天明顯低于對照組；結(jié)腸組織MPO活性從第7天開始增加,到第11天達到最高,第18天恢復正常。
　　 2.PAR-2-AP(1-10μM)抑制大鼠遠端結(jié)腸縱行肌條和環(huán)形肌條自發(fā)性收縮且有一定的劑量-反應關(guān)系

11、,該抑制效應在加入PAR-2-AP2 min內(nèi)最明顯。同樣劑量的PAR-2-RP不影響各肌條的自發(fā)性收縮活動。
　　 加入三種濃度(終濃度分別為1,5,10μM)的PAR-2-AP后2 min,遠端結(jié)腸縱行肌條的張力分別下降8.52±1.37％(P<0.05 vs.RP)、13.77±2.91％(P<0.05vs.RP)和15.27±4.04％(P<0.05 vs.RP),遠端結(jié)腸環(huán)形肌條的張力分別下降10.29±2.71％(P

12、<0.05 vs.RP)、12.95±3.04％(P<0.05 vs.RP)和16.11±3.93％(P<0.05 vs.RP),加入TTX(10μM)預處理30 min不影響PAR-2-AP對結(jié)腸肌條自發(fā)性收縮活動的抑制效應。
　　 3.大鼠痢疾桿菌感染后結(jié)腸遠端環(huán)形肌條對PAR-2-AP舒張作用的敏感性降低,遠端縱行肌條敏感性沒有明顯改變。
　　 4.免疫組織化學證實PAR-2表達于結(jié)腸的環(huán)形肌、縱行肌以及肌間神經(jīng)叢

13、,痢疾桿菌灌胃后第18天,環(huán)形肌上PAR-2表達下降。
　　 5.Western blot檢測結(jié)果表明痢疾桿菌感染大鼠后第11-35天遠端結(jié)腸PAR-2的表達量降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.痢疾桿菌灌胃可以引起遠端結(jié)腸的感染和炎癥反應,遠端結(jié)腸局部炎癥第11天最明顯,第18天消失
　　 2.PAR-2-AP引起結(jié)腸平滑肌發(fā)生舒張,該效應是由平滑肌細胞上的PAR-2介導的。
　　 3.痢疾桿菌感染

14、大鼠后結(jié)腸遠端環(huán)形肌對PAR-2-AP的敏感性降低,這種改變可能與痢疾桿菌感染下調(diào)環(huán)形肌上PAR-2表達有關(guān)。
　　 第二部分痢疾桿菌感染后空腸腸系膜傳入神經(jīng)敏感性的改變
　　 目的：
　　 腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndorme,IBS)是最常見的功能性腸道疾病,內(nèi)臟高敏感性是IBS的重要臨床表現(xiàn)。部分IBS病人發(fā)病前有腸道感染的病史,這類IBS被稱為感染后IBS(post infect

15、ions IBS,PI-IBS)。目前常用的PI-IBS動物模型是用化學物質(zhì)刺激和寄生蟲感染造成腸道炎癥,本研究擬采用痢疾桿菌灌胃造成大腸炎模型,研究痢疾桿菌感染后空腸腸系膜傳入神經(jīng)對機械和化學刺激敏感性的改變。
　　 方法
　　 1.腸炎模型建立同第一部分,取空腸組織做HE染色和髓過氧化物酶活性測定,方法同第一部分
　　 2.腸系膜傳入神經(jīng)放電記錄技術(shù)
　　 4.實驗步驟
　　 結(jié)果：
　

16、　 1.空腸段腸系膜傳入神經(jīng)呈現(xiàn)規(guī)律的自發(fā)放電,平均放電頻率為8±2 spikes/sec。
　　 2.痢疾桿菌灌胃處理后不同時間點空腸段沒有觀察到炎癥反應,與對照組大鼠相比,SF-treated組大鼠空腸髓過氧化物酶活性沒有明顯改變。
　　 3.灌流液中加入5-HT后,正常和痢疾桿菌感染大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)放電都明顯增加；與對照組相比,灌胃處理后第25天,大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)電活動對5-HT的反應性沒有明顯改

17、變。
　　 4.機械擴張刺激引起正常和痢疾桿菌灌胃大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)放電明顯增加；與對照組相比,在痢疾桿菌灌胃處理后第25天,空腸段腸系膜傳入神經(jīng)對機械擴張刺激的敏感性增加。
　　 5.緩激肽興奮正常和痢疾桿菌灌胃大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電活動,與對照組相比,在痢疾桿菌灌胃處理后第25天,大鼠空腸段腸系膜傳入神經(jīng)對緩激肽刺激的敏感性明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 痢疾桿菌灌胃處理后第25天,空