喉癌患者中醫(yī)體質(zhì)類型分析及痰瘀對(duì)喉癌裸鼠miRNA表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的:
　　喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率較高，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康。中醫(yī)體質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，目前關(guān)于體質(zhì)與喉癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究并不多見，探究與喉癌發(fā)生相關(guān)的中醫(yī)體質(zhì)類型，對(duì)于臨床中調(diào)整患者體質(zhì)偏頗，預(yù)防喉癌有著重要的意義。導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)經(jīng)過20多年的研究，逐步發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了痰瘀相關(guān)證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證）是喉癌形成的基本證型，揭示痰瘀相關(guān)證候與喉癌形成之間的基因?qū)W機(jī)制，有望為喉癌的藥物治

2、療提供準(zhǔn)確靶點(diǎn)。本課題將通過臨床調(diào)查研究，探究喉癌患者的中醫(yī)體質(zhì)類型特點(diǎn)，為喉癌的早期預(yù)防提供依據(jù);其次，將通過實(shí)驗(yàn)研究，觀察痰瘀相關(guān)證候?qū)戆┞闶竽[瘤生長(zhǎng)的影響，并檢測(cè)miRNA在痰瘀相關(guān)證候裸鼠腫瘤模型上的差異表達(dá)情況，分析痰瘀相關(guān)證候影響喉鱗癌細(xì)胞增殖的基因?qū)W機(jī)制。
　　方法:
　　1.文獻(xiàn)研究
　　通過文獻(xiàn)回顧，總結(jié)中醫(yī)體質(zhì)的概念、分型、影響因素等，分析中醫(yī)體質(zhì)與發(fā)病的關(guān)系，回顧中醫(yī)體質(zhì)與惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

3、。
　　2.臨床研究
　　根據(jù)國醫(yī)大師王琦教授的“體質(zhì)九分法”建立臨床病例觀察表，采用問卷調(diào)查法，根據(jù)嚴(yán)格的納排標(biāo)準(zhǔn)，納入喉癌組患者67例，來源于2014年1月-2017年2月期間在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診并確診為喉癌的患者;對(duì)照組53例，來源于同期收集的廣州市白云區(qū)三元里社區(qū)健康居民。對(duì)兩組人群進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)評(píng)分，建立數(shù)據(jù)庫，判斷兩組人群的中醫(yī)體質(zhì)類型，分析喉癌患者的中醫(yī)體質(zhì)特點(diǎn)。
　　3.實(shí)驗(yàn)研究
　　將

4、Hep-2喉鱗癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代;制作痰瘀相關(guān)證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證）裸鼠模型，并對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià);將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hep-2喉癌細(xì)胞接種到已造模成功的裸鼠右側(cè)腋窩部皮下，觀察各組裸鼠在體瘤生長(zhǎng)情況;腫瘤取材后以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，以高通量法檢測(cè)瘤體細(xì)胞中的miRNA表達(dá)情況，并通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。
　　成果:
　　1.臨床研究
　　對(duì)67例喉癌患者及53例健康對(duì)照組人群進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)分析，

5、兩組人群的體質(zhì)類型總體比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明兩組人群體質(zhì)類型存在差異。同時(shí)，對(duì)每一體質(zhì)類型分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)喉癌組瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)人數(shù)明顯多于對(duì)照組(P＜0.05)，喉癌組平和質(zhì)人數(shù)明顯少于對(duì)照組(P＜0.05)。九種體質(zhì)類型中除平和質(zhì)外，其余八種皆為偏頗體質(zhì)。喉癌組中平和質(zhì)7例，占本組總?cè)藬?shù)的10.4％，偏頗體質(zhì)60例，占89.6％;對(duì)照組中平和質(zhì)27例，占本組總?cè)藬?shù)的50.9％，偏頗體質(zhì)26例，占49.1％。
　

6、　調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，八種偏頗體質(zhì)既可單獨(dú)出現(xiàn)，也可與其他偏頗體質(zhì)兼見，同時(shí)具有兩種及以上偏頗體質(zhì)者稱為兼夾體質(zhì)。喉癌組的60例偏頗體質(zhì)中，屬單一偏頗體質(zhì)者27例，占40.3％，屬兼夾體質(zhì)者33例，占49.3％;對(duì)照組的26例偏頗體質(zhì)中，屬單一偏頗體質(zhì)者11例，占20.8％，屬兼夾體質(zhì)者15例，占28.3％。喉癌組中瘀血質(zhì)24例（包括單一瘀血質(zhì)6例，瘀血質(zhì)兼其他偏頗體質(zhì)18例），對(duì)照組中瘀血質(zhì)3例（包括單一瘀血質(zhì)0，瘀血質(zhì)兼其他3例），兩者比較

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。喉癌組中痰濕質(zhì)25例（包括單一痰濕質(zhì)3例，痰濕質(zhì)兼其他22例），對(duì)照組中痰濕質(zhì)6例（包括單一痰濕質(zhì)0，痰濕質(zhì)兼其他6例），兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。其余六種體質(zhì)類型（氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、濕熱質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)）分別比較，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)為虛性體質(zhì)類型，將兩組虛性體質(zhì)者分別合并后，各體質(zhì)類型人數(shù)由多到少排序?yàn)?喉癌組，虛性體質(zhì)＞痰濕質(zhì)＞瘀血質(zhì)

8、＞濕熱質(zhì)＞氣郁質(zhì)＞平和質(zhì)＞特稟質(zhì);對(duì)照組，平和質(zhì)＞虛性體質(zhì)＞濕熱質(zhì)＞氣郁質(zhì)＞痰濕質(zhì)＞瘀血質(zhì)＞特稟質(zhì)。虛性體質(zhì)者在兩組人群中均占有較大比例，喉癌組46.3％，對(duì)照組32.1％。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)完成了痰瘀相關(guān)證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證）裸小鼠模型的制作和評(píng)價(jià):與對(duì)照組比較，血瘀證組裸小鼠出現(xiàn)了形體消瘦，時(shí)有寒戰(zhàn)，反應(yīng)減弱，皮膚暗紅無光澤，耳、爪、尾部等出現(xiàn)瘀點(diǎn)瘀斑，背部青筋顯露，唇周暗紅，舌色紫黯等表現(xiàn)，以及體

9、重增長(zhǎng)緩慢，攝食量、飲水量減少，尾出血時(shí)間和凝血時(shí)間（玻管法）顯著縮短等癥狀體征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化，符合血瘀證動(dòng)物模型的特征性表現(xiàn);痰證組裸小鼠出現(xiàn)了肥胖、行動(dòng)遲緩、嗜臥少動(dòng)、喜扎堆、大便黏膩不成形等表現(xiàn)，以及體重增長(zhǎng)加快，攝食量、飲水量減少，血脂顯著升高等癥狀體征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化，符合痰證動(dòng)物模型的特征性表現(xiàn);痰瘀互結(jié)證組裸小鼠出現(xiàn)了形體稍胖，嗜臥少動(dòng)，行動(dòng)遲緩，蜷臥喜扎堆，皮膚暗紅色，耳、爪、尾部出現(xiàn)瘀點(diǎn)瘀斑，背部青筋顯露，唇周暗

10、紅，舌色紫黯，大便黏膩不成形等表現(xiàn)，以及體重增長(zhǎng)緩慢，攝食量、飲水量顯著減少，尾出血時(shí)間和凝血時(shí)間（玻管法）顯著縮短，血脂顯著升高等癥狀體征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化，符合痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型的特征性表現(xiàn)。
　　(2)將喉鱗癌細(xì)胞接種到四組裸鼠腋窩部皮下后成功成瘤。觀察各組裸鼠的在體瘤生長(zhǎng)情況，血瘀證組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組加快，時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)在腫瘤接種后第20天（約第3周），痰證組、痰瘀互結(jié)證組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度與對(duì)照組比較無顯著差異。腫瘤接

11、種后第28天，三個(gè)模型組裸鼠的喉癌體積、喉癌重量與對(duì)照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。
　　(3)通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同模型組裸鼠在體喉癌細(xì)胞的活性，血瘀證組、痰證組、痰瘀互結(jié)證組裸鼠在體喉癌細(xì)胞活性均高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　(4)高通量法測(cè)序結(jié)果:血瘀證組、痰證組、痰瘀互結(jié)證組喉癌裸鼠的喉癌細(xì)胞中均出現(xiàn)miRNA異常表達(dá)。血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與對(duì)照組比較，血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與痰證組比較，均有大量miRN

12、A表達(dá)上調(diào)或下調(diào);而痰證組與對(duì)照組比較、血瘀證組與痰瘀互結(jié)證組比較，miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)數(shù)量相對(duì)較少。經(jīng)去重復(fù)、文獻(xiàn)回顧篩選后初步確定10個(gè)miRNA為血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證影響喉癌裸鼠喉癌細(xì)胞miRNA異常表達(dá)的目的基因，經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)有5個(gè)miRNA在模型組裸鼠喉癌細(xì)胞中出現(xiàn)顯著異常表達(dá)，分別為miR-27a-5p、miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p。血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與

13、對(duì)照組比較異常表達(dá)的miRNA相同:miR-27a-5p呈高表達(dá);miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p呈低表達(dá)。痰證組與對(duì)照組比較:miR-27a-5p呈高表達(dá)，miR-708-5p呈低表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.臨床研究
　　喉癌患者中醫(yī)體質(zhì)類型以瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)為主，兼有較多虛性體質(zhì)，據(jù)此推測(cè)喉癌的發(fā)生可能與瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)、虛性體質(zhì)有關(guān)。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究

14、　　血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使喉癌細(xì)胞活性增強(qiáng)、促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖;在體外成瘤實(shí)驗(yàn)中，血瘀證對(duì)喉癌細(xì)胞增殖促進(jìn)作用更為顯著;血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖的基因?qū)W機(jī)制可能是通過使喉癌細(xì)胞中的miRNA發(fā)生異常表達(dá)實(shí)現(xiàn)的:血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使miR-27a-5p表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖，推測(cè)miR-27a-5p可能為促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖的基因;血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使miR-708-5p表達(dá)下調(diào)，血瘀證、痰瘀互結(jié)證

15、可使miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p表達(dá)下調(diào)，從而使喉癌細(xì)胞的增殖失去抑制作用，促進(jìn)喉癌的發(fā)展，推測(cè)miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p可能為抑制喉癌細(xì)胞增殖的基因。
　　3.展望
　　調(diào)整體質(zhì)偏頗，改善瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)、虛性體質(zhì)對(duì)預(yù)防喉癌有著重要的意義。在喉癌的治療中，對(duì)血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證的喉癌可有望通過“化痰祛瘀”法治療，以抑制喉癌細(xì)胞的增