血紅素加氧酶-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞減輕大鼠小腸移植急性排斥反應的實驗研究.pdf

1、目的：在建立穩(wěn)定的、可重復性強的大鼠異位小腸移植急性排斥反應模型的基礎上，探討血紅素加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs）在減輕大鼠小腸移植急性排斥反應，改善小腸移植大鼠預后中的作用。
　　方法：本研究首先采用梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)的方法提取Lewis大鼠股骨及脛骨中的BMMSCs，培養(yǎng)至3代以后，通過轉(zhuǎn)染空腺

2、病毒（adenovirus，Ad）以及攜帶有HO-1基因的腺病毒制備腺病毒空載的BMMSCs（Ad/BMMSCs）和HO-1基因修飾的BMMSCs（Ad/HO-1/BMMSCs）；以BN大鼠為供體，以Lewis大鼠為受體，建立異位大鼠小腸移植排斥反應模型。對照組供受體均為Lewis大鼠。通過大鼠存活情況以及組織病理學變化分析小腸移植排斥反應模型建模是否成功；在成功建模的基礎上，術后經(jīng)陰莖背靜脈分別給予未處理的 BMMSCs、Ad/BMM

3、SCs以及Ad/HO-1/BMMSCs各1×107個，等量的生理鹽水注射作為基礎對照。觀察術后各組大鼠的生存狀況并分析生存率。分別于術后1、5、7、10 d時搜集移植腸組織檢測組織病理學以及細胞凋亡情況，并通過免疫組織化學、Western Blot、PCR測定移植腸組織中HO-1蛋白以及mRNA的表達。同時，保留各組血清樣本檢測血清中各種細胞因子的水平。此外，提取脾臟淋巴細胞檢測其中NK細胞（natural killer cell，NK

4、 cell）的活性以及調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）的水平。
　　結果：經(jīng)培養(yǎng)鑒定，由大鼠股骨及脛骨提取的BMMSCs易培養(yǎng)、數(shù)量多、純度高，腺病毒轉(zhuǎn)染不會改變其生物細胞學特性；在反復預實驗練習后熟練掌握小腸移植技術。在BN至Lewis的異位小腸移植急性排斥反應模型中，術后3 d內(nèi)無明顯的急性排斥反應發(fā)生，術后5 d時會發(fā)生輕至中度的急性排斥反應，術后7 d時會發(fā)生中至重度的急性排斥反應，而至術后

5、第10 d，所有的移植大鼠均表現(xiàn)為重度的急性排斥反應。隨著急性排斥反應的加重，移植小腸表現(xiàn)為越來越嚴重的炎性細胞浸潤、腺窩上皮損傷、腺窩凋亡小體形成、組織結構破壞以及粘膜潰瘍等。幾乎所有的移植大鼠均于14 d天之內(nèi)死亡，中位生存時間為10 d；BMMSCs治療顯著改善了移植大鼠地生存狀況并顯著提高了其術后生存率，組織病理學改變明顯改善，排斥指數(shù)、細胞凋亡及 NK細胞活性顯著下降。血清IL-10、TGF-β等與抗炎或 Tregs分化相關的

6、細胞因子表達水平顯著升高，而與促炎或 Th17分化相關的細胞因子 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及 IFN-γ的表達水平則明顯降低。此外，BMMSCs還誘導了Tregs的生成。但BMMSCs的以上效應一般7 d內(nèi)較強，在10 d時便呈下降趨勢；HO-1基因修飾BMMSCs，顯著提高了BMMSCs中HO-1蛋白的表達，提高了BMMSCs在體內(nèi)的存活率，并進一步增強了BMMSCs保護移植小腸的作用。與未處理的BMMS

7、Cs治療相比，Ad/HO-1/BMMSCs治療進一步提高了移植大鼠術后生存率，組織病理學變化及細胞凋亡進一步好轉(zhuǎn)，NK細胞活性顯著下降而Tregs水平顯著升高，細胞因子 IL-10、TGF-β顯著上升而 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ則顯著降低。
　　結論：大鼠股骨、脛骨提取的BMMSCs數(shù)量多、純度高，是實驗理想的BMMSCs來源；以腺病毒轉(zhuǎn)染來實現(xiàn)BMMSCs的基因修飾是可行的；BMMSCs