IGF-1對肌萎縮側索硬化細胞穩(wěn)轉模型的保護作用.pdf

1、肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種進行性、致死性的神經系統(tǒng)變性性疾病，主要侵犯腦和脊髓的上、下運動神經元，最終導致癱瘓和死亡。然而其確切的發(fā)病機制目前仍不清楚并且尚無行之有效的治療手段。
　　最近，在ALS和含有泛素陽性包涵體的額顳葉癡呆患者的運動神經元及膠質細胞中均發(fā)現了異常泛素化的蛋白聚集體，主要成分是43KD的TAR DNA結合蛋白(TDP43)，它由TARDBP基因編

2、碼。正常情況下TDP-43主要分布于細胞核，參與剪切和轉錄調控。TDP43由414個氨基酸組成，包括兩個RNA識別區(qū)域和一個富含甘氨酸的羧基末端區(qū)域。最近研究表明TARDBP突變是ALS較為常見的一種基因突變，并且?guī)缀跛信cALS相關的TDP43突變都源于其羧基末端的甘氨酸富含區(qū)域。然而目前我們仍不清楚，突變的TDP-43是通過毒性功能的獲得還是正常功能的丟失來介導神經元退行性變的。突變的TDP43可以被截斷，產生一個25KD的羧基末端

3、片段:TDP25，它更容易錯誤折疊和聚集，在ALS的病理過程中發(fā)揮著重要作用。據文獻報道，穩(wěn)定表達TDP25能夠誘導細胞產生顯著的氧化應激及凋亡，具有細胞毒性作用。
　　運動神經元正常的生理功能依賴于神經生長因子持續(xù)、嚴格的調控，在運動神經元不同的發(fā)育階段，神經生長因子參與神經元增殖、軸突生長、突觸形成等重要生理過程。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是一種神經生長因子，屬于胰島素家族。由于它在生長及代謝方面的作用，IGF-1已經

4、用于生長因子缺乏和糖尿病等疾病的治療。目前，越來越多的人開始關注它對神經變性性疾病的治療作用。最近研究表明IGF-1對中樞及外周神經系統(tǒng)都具有神經保護作用。IGF-1可以激活PI3K/Akt和P44/42 MAPK信號通路，產生一系列的細胞保護效應，包括:細胞增殖、分化、抑制凋亡。另外，JPK、P38 MAPK和mTOR信號通路也與IGF-1相關。然而IGF-1信號系統(tǒng)十分復雜，受IGF-1受體(IGF-1R)及IGF-1結合蛋白(IG

5、FBPs)等多種因子的調控。對IGF-1系統(tǒng)的深入研究有可能為ALS治療提供一個新的靶點。
　　目的:研究IGF-1對穩(wěn)定表達TDP25蛋白的NSC34細胞的保護作用。
　　方法:本研究采用TDP25穩(wěn)轉的NSC34細胞作為肌萎縮側索硬化的細胞模型。用不同濃度(0ng/ml，0.1 ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml) IGF-1干預穩(wěn)轉的NSC34細胞24小時，顯微鏡下觀察不同濃

6、度IGF-1干預后細胞形態(tài)變化，并通過CCK-8試劑盒檢測不同濃度IGF-1對細胞活力的影響，確定IGF-1最適藥物濃度;采用適當濃度的IGF-1干預細胞24小時后，通過LDH及MDA試劑盒檢測IGF-1是否能減少TDP25產生的細胞毒性;采用適當濃度的IGF-1干預細胞24小時后，通過Western免疫印記法檢測IGF-1對caspase3（凋亡標記蛋白）和HO-1（抗氧化蛋白）表達的影響。
　　結果:(1)通過免疫印跡法檢測到

7、穩(wěn)轉TDP25質粒的NSC34細胞中有外源性TDP25蛋白的表達，成功建立ALS細胞穩(wěn)轉模型。
　　(2)不同濃度(0-1000ng/ml)IGF-1干預穩(wěn)轉NSC34細胞后，鏡下觀察發(fā)現100ng/ml IGF-1能顯著促進細胞軸突生長，維持細胞良好形態(tài);CCK-8檢測發(fā)現除0.1 ng/ml IGF-1外，其他不同濃度IGF-1給藥組均能提高細胞活力，并且10ng/ml及100ng/ml的IGF-1效果更好，所以最終我們選擇1

8、0ng/ml和100ng/ml作為IGF-1的最適濃度。依次用0ng/ml、10ng/ml（低劑量）、100ng/ml（高劑量）IGF-1干預穩(wěn)轉NSC34細胞24小時后，分別檢測不同IGF-1濃度下細胞毒性LDH及MDA水平變化，結果顯示與對照組比，給藥組兩個濃度下的IGF-1均能顯著降低LDH及MDA水平，且兩個給藥劑量組之間無明顯統(tǒng)計學差異。
　　(3)依次用0ng/ml、10ng/ml（低劑量）、100ng/ml（高劑量）

9、IGF-1干預穩(wěn)轉NSC34細胞24小時后，通過western印跡檢測caspase3、HO-1蛋白表達水平變化，結果顯示，與對照組相比，給藥組兩個濃度下的IGF-1均能抑制caspase3表達水平，并上調HO-1表達水平，而且高劑量組作用效果優(yōu)于低劑量組。
　　結論:在穩(wěn)定表達TDP25蛋白的ALS細胞模型中，IGF-1能夠降低TDP25產生的細胞毒性，抑制凋亡和氧化應激，且高劑量的IGF-1能夠促進細胞軸突生長，具有明顯的細胞