假蕈狀芽孢桿菌34KD纖溶酶基因的克隆與表達.pdf

1、本論文重點研究了假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)34 kD纖溶酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達，并做了一些枯草桿菌表達方面的研究。主要研究結(jié)果如下: 本實驗室顧從土壤中分離篩選出具有纖溶酶活性的假蕈狀芽孢桿菌，且對此菌株的纖溶酶蛋白進行分離純化，得到34kD單一活性組分，埃德曼降解法測得N端序列為VTGTNAVGTGKGVLG。 根據(jù)此十五個氨基酸在NCBI上進行比對，找到了十種100％同

2、源蛋白序列，并根據(jù)相對應的編碼序列的同源性設計了一對簡并引物，并在5'端分別加入了EcoRI和XhoI的酶切位點。以產(chǎn)纖溶酶的菌株假蕈狀芽孢桿菌的基因組DNA為模板，利用設計的引物進行PCR，獲得了一個完整的兩頭含酶切位點的纖溶酶基因BpFE。 使用EcoRI和XhoI雙酶切載體pGEX-4T-2和BpFE基因，通過連接構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-BpFE，并對BpFE基因進行了測序。結(jié)果表明:此細菌纖溶酶基因全長1701 bp，編

3、碼566個氨基酸。與相似性最高的序列bacillolysin(Bacillus cereusH3081.97)比僅存在5個氨基酸的差異，含有中性鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。 將重組質(zhì)粒pGEX-BpFE利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG、低溫誘導后，SDS-PAGE顯示胞內(nèi)含有表達條帶，表達產(chǎn)物的相對分子量大小為98kD，比預計的分子量(90kD)稍大。酪蛋白平板法和纖維蛋白板法均顯示1.0 mmol/L IPTG

4、，26℃和30℃誘導5小時后的重組菌經(jīng)超聲波破壁后的胞內(nèi)蛋白有活性。 但是大腸桿菌表達系統(tǒng)大部分為胞內(nèi)表達，這樣就為生產(chǎn)帶來了很多的不便。而枯草芽孢桿菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特點，被認為是表達和分泌異源蛋白的理想受體。 以pUC19-5-2為模板，通過PCR方法得到含sacB基因的啟動子、200bp的類似轉(zhuǎn)錄終止信號的序列、核糖體結(jié)合位點及編碼29個氨基酸的信號序列，將此535bp序列通過酶切連接到大腸-枯草穿梭質(zhì)