慢病毒介導的過表達Omp25基因對小膠質細胞的影響及其分子機制.pdf

1、目的：通過慢病毒介導的Omp25基因轉染小鼠小膠質(BV2)細胞，觀察Omp25蛋白的表達情況，探索布魯氏桿菌毒力因子Omp25過表達對BV2細胞的炎癥反應作用，為進一步揭示0mp25基因在布魯氏桿菌中樞神經系統(tǒng)感染中的分子致病機制提供理論基礎。
　　方法：選取處于對數(shù)期生長的BV2細胞，實驗分為三組：感染Omp25重組慢病毒過表達載體（LV-Omp25-GFP組）作為實驗組，感染慢病毒陰性載體組（LV-GFP組）作為陰性對照組，

2、另設空白對照組。感染72h后：在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，判斷慢病毒轉染效率，同時流式細胞儀熒光分選穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP)的BV2細胞，用于以下實驗：
　　①電子透射電鏡：觀察慢病毒感染組及空白對照組細胞結構，觀察細胞在感染前后超微結構的變化。
　?、诜謩e提取各組RNA、DNA，半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和Western blot技術檢測細胞中O

3、mp25基因mRNA和蛋白的表達水平，從轉錄水平和蛋白水平驗證Omp25表達成功與否。
　?、鄯謩e收集LV-Omp25-GFP組、LV-GFP組、空白對照組細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測細胞炎性因子TNF-α、IL-6、NO的分泌。
　　④NF-κB信號通路特異性抑制劑BAY11-70825um預處理BV2細胞60min后，加入MOI值為50的LV-Omp25-GFP50ul感染BV2細胞，同時設置對照組，72h后收集實

4、驗組及對照組細胞及培養(yǎng)上清液，RT-PCR及ELISA檢測炎性因子mRNA水平和蛋白水平的表達情況。多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：①慢病毒感染BV2細胞72小時后，在熒光倒置顯微鏡下觀察LV-GFP組和LV-Omp25-GFP組熒光顯微鏡下可見GFP的表達，約有超過85％的細胞發(fā)出綠色熒光，空白對照組由于未感染慢病毒，熒光顯微鏡下未見GFP的表達。
　　②ELISA結果顯示

5、，感染72h后，LV-Omp25-GFP組與空白組及LV-GFP組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）,LV-GFP與空白對照組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　③定量PCR結果顯示：以空白對照組為1進行比較，慢病毒組Omp25基因的mRNA表達水平明顯上調，其表達量較空白對照組和GFP組明顯上調，差異均具有明顯的統(tǒng)計學意義（P<0.01），而GFP組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明BV2細胞成功過

6、表達Omp25基因。
　?、躓estern blot結果：LV-Omp25-GFP組較對照組所檢測灰度值升高，提示Omp25慢病毒感染BV2細胞后Omp25蛋白成功過表達。
　?、蓦娮油干潆婄R結果顯示：LV-Omp25-GFP組較對照組細胞內可見長且豐富的偽足，大量的脂質空泡、髓樣小體，線粒體嵴被大量破壞，細胞胞質內有一些大小不等的吞噬泡,其中含多少不等的慢病毒顆粒凝聚，溶酶體增多。
　?、轇V2細胞用BAY11-70

7、82預處理60min后轉染LV-Omp25-GFP，72h收集細胞和培養(yǎng)上清，熒光定量及ELISA分別從mRNA和蛋白水平檢測TNF-α、IL-6、NO的表達。
　　結果：顯示加入信號通路抑制劑后能夠明顯抑制Omp25過表達慢病毒誘導TNF-α、IL-6、NO的產生，證明NF-κB信號通路可能參與誘導促炎因子TNF-α、IL-6、NO的產生。
　　結論：建立Omp25慢病毒過表達載體轉染BV2細胞的模型，推測BV2細胞通過內