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文檔簡介
1、目的:探討瘦素在大鼠跟腱干細(xì)胞(TDSCs)成骨分化及跟腱異位骨化形成過程中的作用及機(jī)制,為異位骨化的預(yù)防和治療提供理論支持。
方法:體外實(shí)驗(yàn),提取大鼠TDSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),用不同濃度的瘦素(1、10、100ng/ml)或100ng/ml瘦素+10nM雷帕霉素處理,3天后通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況,14天后采用堿性磷酸酶(ALP)染色/活性實(shí)驗(yàn)檢測ALP表達(dá),茜紅素染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成,熒光定量PCR檢測ALP、
2、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(OSX)及骨鈣素(OCN),蛋白免疫印跡檢測Runx2、OSX以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)信號(hào)通路下游的磷酸化核糖體S6蛋白激酶(PS6K1)和磷酸化核糖體S6蛋白(PS6)的表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn),選取6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠建立跟腱中段切斷術(shù)模型,隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、異位骨化組(HO)、異位骨化+雷帕霉素組(HO+RA)、異位骨化
3、+瘦素組(HO+LEP)、異位骨化+瘦素+雷帕霉素組(HO+LEP+RA),采用瘦素及雷帕霉素處理10周,跟腱取材行伊紅-蘇木素染色檢測鈣化面積,micro-CT檢測異位骨化體積,免疫組織化學(xué)檢測瘦素、Runx2、OSX及PS6的表達(dá)量。
結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn):瘦素在1-100ng/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)TDSCs的增殖沒有顯著的毒性作用,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);不同濃度的瘦素(1-100ng/ml)促進(jìn)TDSCs成骨分化過程中
4、ALP表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成,并呈濃度依賴性增加,在100ng/ml瘦素時(shí)達(dá)到最大作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);不同濃度的瘦素(1-100ng/ml)促進(jìn)ALP、Runx2、OSX及OCN的mRNA表達(dá),并隨著瘦素濃度的增加而增加,在100ng/ml瘦素時(shí)表達(dá)最強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);不同濃度的瘦素(1-100ng/ml)促進(jìn)Runx2、OSX、PS6K1及PS6蛋白的表達(dá),并隨著瘦素濃度的增加而增加,在100n
5、g/ml瘦素時(shí)表達(dá)最強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);瘦素+雷帕霉素組較瘦素組的Runx2、OSX、PS6K1及PS6蛋白表達(dá)量均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。體內(nèi)試驗(yàn):HO組較control組的瘦素表達(dá)明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);HO+LEP組較HO組和HO+LEP+RA組的鈣化面積、異位骨化體積顯著增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);HO+RA組較HO組的鈣化面積和異位骨化體積顯著降低,
6、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);HO+LEP組較HO組和HO+LEP+RA組的Runx2、OSX及PS6表達(dá)顯著增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);HO+RA組較HO組的Runx2、OSX及PS6表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
結(jié)論:瘦素上調(diào)mTORC1信號(hào)通路加速TDSCs成骨分化和跟腱異位骨化的形成,mTORC1信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素可有效抑制瘦素誘導(dǎo)的TDSCs成骨分化和跟腱異位骨化形成,為
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